甘蓝型油菜MYBL2基因的启动子及其应用制造技术

本发明专利技术公开了甘蓝型油菜MYBL2基因的启动子及应用，属于生物技术和植物基因工程领域，其核苷酸序列如SEQ ID No.1所示。本发明专利技术从油菜品种“中双9号”中克隆了MYBL2基因的启动子PBnMYBL2，并对其进行了序列分析及功能验证。实验证明，PBnMYBL2启动子序列由ATG上游2000bp的序列组成，该启动子不仅能够启动外源基因GUS在拟南芥或烟草中表达，并且与一般的胁迫诱导型启动子不同，该启动子的转录激活活性在受到多种非生物逆境胁迫时可被诱导或抑制。本发明专利技术利用该启动子代替组成型启动子，获得诱导型启动子的双元表达载体；利用遗传转化技术将其导入植物基因组中，可以实现对目的基因的定向操作，获得可诱导抑制目的基因表达的转基因植株。转基因植株。转基因植株。

【技术实现步骤摘要】
甘蓝型油菜MYBL2基因的启动子及其应用


[0001]本专利技术涉及生物技术和植物基因工程
，更具体地说，它涉及甘蓝型油菜MYBL2基因的启动子及其应用。

技术介绍

[0002]植物在生长发育过程中会受到不同环境所带来的非生物胁迫，即在非生物条件下影响植物的正常生长，如冷害、干旱、高盐、高温以及重金属毒害等。这些极端环境条件在植物的每一生长阶段都有着不同程度的消极作用，从而导致植物生长受阻，影响农作物产量。特别是对于像油菜一类的越冬作物而言，虽然主要分布在长江流域，但降雨不均以及冬季冻害造成农作物大量减产，使我国农业发展也受到极大阻碍。
[0003]启动子是位于基因5
’
端上游的一段能过活化RNA聚合酶的DNA序列，它能够准确结合模板DNA，激发或者抑制基因的转录。此外，它还能调控转录的起始时间、基因的表达丰度，是基因表达的核心调控元件。根据基因表达情况，可将启动子分为组成型、组织特异型和诱导型三类。在转基因植物中，通常是利用组成型启动子过表达外源基因，而正常条件下外源基因过量表达会影响植物的生长发育，所以组成型启动子持续过量地表达外源基因会阻碍植物的生长并且减少其产量。因此，通过使用逆境诱导的植物启动子而使外源基因在胁迫情况下表达或抑制表达的方法来培育抗逆作物新品种，不仅会获得目的产物、达到预定目标，而且也不会产生副作用。
[0004]通过开发利用新型启动子与抗逆相关基因的表达盒，能够很大程度提高植物的应激响应能力。但是我们对于诱导型启动子的研究相对于组成型启动子来说起步较晚，先前的植物转基因工程中用到最多的就是CaMV花椰菜花叶病毒的35S启动子，在各项研究中发现，这种组成型启动子在普通条件下也能驱动一些外源胁迫相关基因的表达，但可能会造成大量的基因功能冗余，还会导致基因之间因为竞争关系而带来的资源浪费，甚至可能直接影响转化植株的正常生长，如转化植株中经常出现矮茎、叶片卷曲发黄等负面表型，而诱导型启动子正好弥补了这些不足，在未受到胁迫条件下它并不会表现出转录激活活性，只有在干旱、寒冷、盐碱等非生物逆境中才会驱动下游基因的转录，这在保证植物抗逆性提高的同时使副作用最小化。
[0005]在油菜BnMYBL2基因的研究中发现，MYBL2可通过竞争抑制bHLH转录因子，从而抑制其成为TTG1以及PAP1/PAP2的转录激活复合物，降低植物冷害耐受能力；MYBL2也可与DFR启动子结合并抑制DFR基因的正常转录激活；此外研究发现MYBL2还具有TLLLFR抑制因子的功能，其羧基末端能与TOPLESS家族抑制因子互作；MYBL2还可通过抑制花青素的合成而降低植株的寒冷耐受能力，这些可能都与MYBL2基因上游的启动子转录激活活性有关。
[0006]目前在植物基因工程的研究中，应用最为广泛的是CAMV35S组成型启动子，其可驱动外源基因在植物不同组织、不同条件下表达。综上所述，新型诱导型启动子的开发利用对于植物生理生化的研究以及作物遗传育种定向改良具有十分重要的意义。

技术实现思路

[0007]本专利技术提供了一种从油菜中克隆得到一种响应多种逆境的诱导型启动子。
[0008]一种启动子，具有如SEQ ID No:1所示的核苷酸序列。所述启动子是从油菜品种“中双9号”中克隆获得，命名为启动子PBnMYBL2，该启动子为诱导型启动子。
[0009]含有所述DNA分子的表达盒、重组表达载体、转基因细胞系、重组菌和转基因植物也属于本专利技术的保护范围。
[0010]所述重组表达载体为用所述启动子PBnMYBL2替换植物表达载体上的启动子得到的重组表达载体。当带有所述重组表达载体的转基因植物处于逆境条件时，诱导或者抑制下游基因转录水平，提高植物抗逆能力。所述植物低温响应负调控基因可以为MYB15、JAZ1、JAZ4、DEAR1或RAP2.1等转录抑制子及低温敏感基因(刘辉,李德军,邓治.植物应答低温胁迫的转录调控网络研究进展[J].中国农业科学,2014,(18):3523
‑
3533)。
[0011]本专利技术还提供了一种包含所述重组表达载体的转化子。
[0012]所述转化子的宿主细胞为根癌农杆菌。根癌农杆菌和发根农杆菌中细胞中分别含有Ti质粒和Ri质粒，其上有一段T
‑
DNA，农杆菌通过侵染植物伤口进入细胞后，可诱导植物受伤部位产生冠婴瘤，并将T
‑
DNA插入到植物基因组中，然后通过减数分裂稳定的遗传给后代，借助农杆菌的感染实现外源基因向植物细胞的转移与整合，然后通过细胞和组织培养技术，再生出转基因植株。
[0013]本专利技术还提供了所述的启动子在培育耐盐或耐低温转基因植物中的应用。优选的，所述植物为油菜一类的双子叶植物。
[0014]以下为本专利技术中涉及的SEQ ID No:1的核苷酸序列：
[0015][0016][0017]本专利技术启动子为从油菜中获得的诱导型启动子，该启动子能够调控基因低温条件下抑制表达并响应多种逆境，使用该启动子对农作物品种进行基因改造，通过该启动子调控下游目的基因提高植物的抗逆性，从而培育出具有优良抗逆能力的转基因植物品种。
附图说明
[0018]图1是本专利技术实施例中低温、PEG、盐以及ABA胁迫处理对4周龄转基因烟草幼苗在不同时间点GUS基因转录水平的影响图；
[0019]图2是本专利技术实施例6中荧光定量RT
‑
PCR检测结果图。
具体实施方式
[0020]以下结合附图1对本专利技术作进一步详细说明。
[0021]实施例1：启动子PBnMYBL2的分离与鉴定。
[0022](1)获得油菜MYBL2基因的启动子序列
[0023]将PBnMYBL2序列进行NCBI BLAST分析，在全基因组序列中查找得到MYBL2基因上游的启动子序列。
[0024](2)引物设计
[0025]根据得到的启动子序列以及选用载体特点分析，设计引物并添加合适的酶切位点。引物序列如下：
[0026]上游引物FPBnMYBL2：
[0027]5’‑
AGTCGACCCGAAATCCGAACCGAAGTAGC
‑3’
[0028]下游引物RPBnMYBL2：
[0029]5’‑
ACCATGGGGTGATGCTTCCACTGACCC
‑3’
[0030]其中上游引物带有SalI酶切位点(GTCGAC)，下游引物带有NcoI酶切位点(CCATGG)。
[0031](3)启动子PBnMYBL2克隆
[0032]以油菜中双9号的基因组DNA为模板，利用上、下游引物PCR扩增启动子PBnMYBL2，PCR扩增条件为：94℃预变性2min；94℃变性30s，54℃退火30s，72℃延伸30s，35个循环；72℃延伸2min。
[0033]PCR扩增产物经1％琼脂糖凝胶电泳检测确认后，回收目的片段，将目的片段连入克隆载体pEasy本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种植物多种逆境响应启动子，其特征是：所述启动子核苷酸序列如SEQ ID No:1所示。2.一种包含如权利要求1所述启动子的表达盒。3.一种包含如权利要求1所述启动子的重组表达载体。4.根据权利要求3所述的重组表达载体，其特征是：所述重组表达载体为权利要求1所述的...

【专利技术属性】
技术研发人员：许本波，田港，翟璐，谢伶俐，沈思思，张学昆，徐劲松，
申请(专利权)人：长江大学，
类型：发明
国别省市：