磷脂酶A2的应用制造技术

本发明专利技术公开了一种磷脂酶A2的应用，所述磷脂酶A2的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示。本发明专利技术发现通过基因工程菌异源表达的西班牙糖丝菌来源的磷脂酶PLA2‑

【技术实现步骤摘要】
磷脂酶A2的应用


[0001]本专利技术属于酶工程
，具体地说，本专利技术涉及一种磷脂酶A2的应用。

技术介绍

[0002]磷脂酶A2(Phospholipase A2，PLA2，EC3.1.1.4)是一大类特异性催化磷脂sn
‑
2位酰基水解、释放游离脂肪酸(free fatty acids)和溶血性磷脂(lysophospholipids)的酶族。PLA2作为一类重要的磷脂改性工具酶，在食品、医药和日化等行业中展现出巨大应用前景。
[0003]目前商品化PLA2来源范围较窄，种类少，价格昂贵，并且表达量和酶活力都普遍较低，天然PLA2难以提取纯化，而基因工程菌异源表达的PLA2主要以包涵体形式存在且酶活力较低。近年来关于磷脂酶A2的表达重组已有大量研究，但仍存在一定的弊端。如Noel和Deng等成功在大肠杆菌里面表达胰腺的PLA2，但以包涵体形式存在的重组蛋白表达量过低。Roberts等人将磷脂酶A2基因与黑曲霉自身高表达的糖化酶基因片段融合，在黑曲霉中表达，蛋白表达量可达10μg/mL，但重组蛋白中存在大量的无酶活蛋白。开展高表达、高酶活、高纯度的磷脂酶A2资源挖掘工作具有重要研究价值和意义。
[0004]造纸领域所用的原料楮皮包括韧皮纤维表皮，其存在大量的高级脂肪酸且分布致密，目前仍采用手工或机械的方法来去除韧皮纤维表皮，再对楮皮进行酶处理(主要采用纤维素酶、木聚糖酶、果胶酶)以杂质脱除，目前的酶处理方法无法去除楮皮的韧皮纤维表皮。

技术实现思路

[0005]基于此，本专利技术的目的在于提供一种磷脂酶A2在造纸中的应用。
[0006]实现上述专利技术目的的技术方案包括如下。
[0007]本专利技术的第一方面，提供了一种磷脂酶A2在造纸中的应用，所述磷脂酶A2的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示。
[0008]本专利技术的第二方面，提供了一种楮皮脱胶除杂的方法，包括以下步骤：将磷脂酶A2与纤维素酶、果胶酶、木聚糖酶按1.8～2.2：1.8～2.2：0.8～1.2：0.8～1.2的体积比混合，得到复配酶，加入至楮皮中进行反应。
[0009]本专利技术发现通过基因工程菌异源表达的西班牙糖丝菌来源的磷脂酶PLA2‑
SE拥有较高酶活、高纯度，且将其与纤维素酶、果胶酶、木聚糖酶进行后，发现其可以实现造纸原料楮皮(包括其韧皮纤维表皮)的脱胶除杂，表明PLA2‑
SE具有优异的脱胶去杂质能力，在造纸方面有着广阔的工业应用前景。
附图说明
[0010]图1为本专利技术实施例1中PLA2‑
SE的全部氨基酸与NCBI数据库中关系最密切的磷脂酶序列(>44％相似性)的多重序列比对结果。
[0011]图2为本专利技术实施例1中PLA2‑
SE的SDS
‑
PAGE电泳检测结果，其中，M：蛋白Marker；
1：总菌裂解液样品；2：裂解液上清液样品；3：裂解液沉淀样品；4：流穿液样品；5：洗脱液样品。
[0012]图3为本专利技术实施例2中PLA2‑
SE复配酶与空载空白处理后楮皮表面结构图。
[0013]图4为本专利技术实施例2中PLA2‑
SE复配酶与空载空白处理后的杂质沉淀图。
具体实施方式
[0014]为了便于理解本专利技术，下面将对本专利技术进行更全面的描述。本专利技术可以以许多不同的形式来实现，并不限于本文所描述的实施例。相反地，提供这些实施例的目的是使对本专利技术公开内容的理解更加透彻全面。
[0015]除非另有定义，本专利技术所使用的所有的技术和科学术语与属于本专利技术的
的技术人员通常理解的含义相同。本专利技术的说明书中所使用的术语只是为了描述具体的实施例的目的，不用于限制本专利技术。本专利技术所使用的术语“和/或”包括一个或多个相关的所列项目的任意的和所有的组合。
[0016]在本专利技术中，首先将已报道的磷脂酶PLA2(PDB:4AUP)作为模板，使用NCBI中的基本局部比对搜索工具(BLAST，可以查找序列之间的局部相似性区域，用来推断序列间的功能和进化关系，帮助识别基因家族成员)在Swiss
‑
Prot数据库中进行磷脂酶A2基因的快速筛选，获取西班牙糖丝菌来源的磷脂酶PLA2‑
SE基因序列。采用全基因合成技术合成PLA2‑
SE基因，通过NcoI和XhoI两个酶切位点将PLA2‑
SE基因插入到pET
‑
28a(+)载体上，得到重组质粒。进一步利用重组质粒在特定培养基(酵母粉0.4％～0.6％、蛋白胨0.8％～1.2％、葡萄糖0.04％～0.06％、乳糖0.15％～0.25％、甘油0.4％～0.6％、磷酸氢二钠23mM～27mM、磷酸二氢钾23mM～27mM、氯化铵48mM～52mM、硫酸钠4mM～6mM、硫酸镁1.5mM～2.5mM)上进行孵育及表达，同时对表达后的产物进行筛选；以所获得的单克隆通过大肠杆菌进行培养与繁殖，对所获得的酶蛋白进行分离及筛选，所获得的PLA2‑
SE磷脂酶拥有较高酶活、高纯度。以所获得的PLA2‑
SE粗酶液通过与纤维素酶、果胶酶、木聚糖酶复配的方式对造纸原料楮皮的脱胶除杂效果进行验证，结果表明PLA2‑
SE具有优异的脱胶去杂质能力。本专利技术开发的PLA2‑
SE磷脂酶丰富了PLA2的种类，同时有着广阔的工业应用前景。
[0017]PLA2‑
SE的氨基酸序列(WP_015104295.1,SEQ ID NO.1)：
[0018]MGAINAPAVTDDYLFSKSLAQFSSIRSGSPYADQLDWSSDGCSWSPDNPFGFK
[0019]FLPACHRHDFGYRNYKRQARFNETSRLRIDDNFKSDLYHQCAGNWACNRTA
[0020]DLYYEAVRKFGASLEHHHHHH
[0021]PLA2‑
SE的编码基因的核苷酸序列(SEQ ID NO.2)：
[0022]ATGGGCGCAATTAATGCCCCGGCAGTGACCGATGATTACCTGTTTAGCAAA
[0023]AGCCTGGCCCAGTTTAGCAGCATTCGTAGCGGTAGCCCGTATGCCGATCAG
[0024]CTGGATTGGAGCAGCGATGGTTGCAGCTGGAGCCCGGATAATCCGTTTGGT
[0025]TTTAAATTTCTGCCGGCCTGCCATCGTCATGATTTTGGCTATCGCAATTATAA
[0026]ACGTCAGGCCCGCTTTAATGAAACCAGCCGTCTGCGCATTGATGATAATTTT
[0027]AAAAGCGATCTGTATCATCAGTGCGCGGGTAATTGGGCCTGCAATCGTACC
[0028]GCCGATCTGTATTATGAAGCCGTGCGTAA本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种磷脂酶A2在造纸中的应用，其特征在于，所述磷脂酶A2的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示。2.根据权利要求1所述的磷脂酶A2在造纸中的应用，其特征在于，所述磷脂酶A2的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示。3.根据权利要求1所述的磷脂酶A2在造纸中的应用，其特征在于，所述磷脂酶A2是通过以下方法制备而得：将磷脂酶A2基因插入到pET
‑
28a(+)载体上，得到重组质粒，再转入至pRARE2感受态细胞中，在自诱导培养基上进行孵育及表达，将单克隆通过大肠杆菌进行培养与繁殖，即得；所述自诱导培养基包括以下原料：酵母粉0.4％～0.6％、蛋白胨0.8％～1.2％、葡萄糖0.04％～0.06％、乳糖0.15％～0.25％、甘油0.4％～0.6％、磷酸氢二钠23mM～27mM、磷酸二氢钾23mM～27mM、氯化铵48mM～52mM、硫酸钠4mM～6mM、硫酸镁1.5mM～2.5mM。4.根据权利要求1～3任一项所述的磷脂酶A2在造纸中的应用，其特征在于，所述应用为使楮皮脱胶除杂。5.一种楮皮脱胶除杂的方法，其特征在于，包括以下步骤：将磷...

【专利技术属性】
技术研发人员：王方华，翦英田，王永华，蓝东明，封陈浩，王斌，陈建，
申请(专利权)人：广东优酶生物制造研究院有限公司，
类型：发明
国别省市：