一种基于谍反应的拓扑结构星型蛋白及其药物偶联体制造技术

本发明专利技术提供一种基于谍反应的拓扑结构星型蛋白，由蛋白1和蛋白2经谍反应通过异肽键连接，所述蛋白1包括EGFR抗体或其抗原结合片段、具有RGD基序的多肽和谍标签，所述蛋白2包括HER2抗体或其抗原结合片段和谍捕手。本发明专利技术进一步公开了由拓扑结构星型蛋白制得的多靶向药物偶联体。所述药物偶联体具有不同程度的良好的靶向能力，能够更多的集中到肿瘤部位，同时在肿瘤部位停留时间更久，具有优越的抑制和治疗肿瘤的能力，相对于普通靶向药物，有效提高了肿瘤抑制和治疗效率。高了肿瘤抑制和治疗效率。高了肿瘤抑制和治疗效率。

【技术实现步骤摘要】
一种基于谍反应的拓扑结构星型蛋白及其药物偶联体


[0001]本专利技术属于生物医药领域，特别是涉及一种用于肿瘤抑制和治疗的拓扑结构的星型蛋白及其药物偶联体。

技术介绍

[0002]随着分子生物学研究的发展，开发用于癌症化疗的新型抗肿瘤药物的策略发生了显著变化。分子靶向治疗代表了通过选择性地改变正常细胞和癌细胞之间或正常组织和癌组织之间的生物学特征差异来实现抗肿瘤效果的尝试。很多靶向药物可以特异性抑制肿瘤细胞或环境中的癌症通路或者与肿瘤生长、进展、细胞凋亡、血管生成和转移有关的关键分子，也在患者中产生了良好的疗效。药物基因组学和蛋白质组学的最新技术进步改进了对预测反应的生物标志物的识别，从而确定了更有可能对这种治疗产生反应的患者。然而，尽管其中一些新化合物取得了长足的进步，并已投入临床成为癌症患者的新型治疗方式，但治愈率仍然较低，尤其是在具体的患者治疗案例中，这些新分子靶点的类型仍需要不断的确认和个体化定制。为了解决不同肿瘤类型的靶点差异，以及靶点失效问题，多靶向分子靶向治疗开始逐渐走入人们的视野。最近，许多作用于不同靶标的分子靶向治疗剂已经被开发。从药物开发过程来看，这些药物被称为分子靶向药物，但不一定单独作用于任何特定目标，即它们选择性地修饰某几个目标。由于信号转导系统由复杂的网络组成，因此多靶向分子可能通过同时阻断所涉及的多个途径来参与抑制肿瘤生长。
[0003]表皮生长因子受体家族在肿瘤的生长转移过程具有至关重要的意义，也是抗肿瘤药物的重要靶点。靶向人表皮生长因子受体1和2的抗体药物、抗体药物偶联体和小分子抑制剂已经有很多上市产品，比如西妥昔单抗、曲妥珠单抗、T
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DM
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1、吉非替尼、阿法替尼、达克替尼、吡咯替尼等，在肿瘤特别是乳腺癌的治疗方面取得了巨大的成功。但是靶向药物的耐药仍然是一个亟待解决的难题。靶向药物的耐药存在多种机理，其中旁路信号的激活是一个重要的方面。大量研究表明表皮生长因子受体1和2的信号通路以及整合素通路之间具有错综复杂的相互作用。当一个受体被抑制以后，其他受体可能会被激活，进而诱导下游信号的持续激活。因此，同时靶向抑制具有相互作用的多个受体靶标可以最大限度的抑制相关的信号通路，最终实现抗肿瘤效应的最大化。而如何将多种靶向基元有效的融合在同一个分子中是一个极大地挑战，特别是针对大尺寸的抗体药物。更重要的是，目前仍未有多特异性的抗体药物偶联体产品上市。
[0004]传统多特异性抗体的制备需要较高的技术壁垒和复杂的工艺条件，而将靶向基元串联形成重组蛋白可能会影响靶向基元的生物活性，因此本专利技术提出构建星型拓扑结构的多特异性重组蛋白可以同时结合多个肿瘤靶标。在空间上，最大程度的降低空间位阻对各个靶向基元的影响，为靶标的结合创造更多的机会，进而更好的结合靶标达到抑制相关信号通路的作用。进一步构建星型拓扑结构的多特异性重组蛋白药物偶联体，通过多重靶标的同时结合，将药物更多的递送进入肿瘤组织。

技术实现思路

[0005]谍反应是谍标签(SpyTag)和谍捕手(SpyCatcher)之间自发形成异肽键的反应过程。该反应的两个组分完全基于天然氨基酸单元，可以通过基因编码的方式直接将化学反应性写入蛋白质的序列中，因而在蛋白质工程、生物材料、化学生物学和合成生物学等方面具有广泛的前景。
[0006]本专利技术基于谍反应的技术构思，分别设计了两条含有谍标签和谍捕手的具有多靶点的多肽，通过谍标签(SpyTag)和谍捕手(SpyCatcher)序列中的氨基酸残基形成异肽键(两个氨基酸通过侧链羧基或侧链氨基形成的肽键)，获得一种拓扑结构星型蛋白(谍标签
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谍捕手复合物)，所述拓扑结构星型蛋白能够识别多个靶点，靶向性强，能够更多的集中到肿瘤部位，同时在肿瘤部位停留时间更久，具有优越的抑制和治疗肿瘤的能力，相对于普通靶向药物，有效提高了肿瘤抑制和治疗效率。
[0007]本专利技术具体技术方案如下：
[0008]一种拓扑结构星型蛋白，由蛋白1和蛋白2经谍反应通过异肽键连接，所述蛋白1包括EGFR抗体或其抗原结合片段、具有RGD基序的多肽和谍标签，所述蛋白2包括HER2抗体或其抗原结合片段和谍捕手。
[0009]本专利技术技术方案中，EGFR抗体或其抗原结合片段、具有RGD基序的蛋白和HER2抗体或其抗原结合片段为肿瘤靶向性功能片段，使星型蛋白能够同时靶向EGFR、HER2、整合素三种靶标。谍标签和谍捕手序列为实现蛋白1和蛋白2连接的功能片段。
[0010]所述蛋白1中的EGFR抗体或其抗原结合片段、具有RGD基序的多肽和谍标签可以以任意顺序排列，通过连接肽或直接连接。
[0011]所述蛋白2中的HER2抗体或其抗原结合片段和谍捕手可以以任意顺序排列，通过连接肽或直接连接。
[0012]本专利技术一个具体的方式为：蛋白1以EGFR抗体抗原结合片段、连接肽、谍标签、连接肽、iRGD肽链按序连接形成肽链。
[0013]蛋白2以HER2抗体抗原结合片段、连接肽、谍捕手按序连接形成肽链。
[0014]将蛋白1和蛋白2按一定比例(优选摩尔比1：1)混合后即得本专利技术所述的拓扑结构星型蛋白。
[0015]上述EGFR抗体或其抗原结合片段、具有RGD基序的多肽和HER2抗体或其抗原结合片段可以为本
现有技术公开的所有可实现肿瘤靶向的功能片段，所述抗体可以是IgG1、IgG2、IgG3或IgG4形式的抗体，所述抗原结合片段可以为Fab、Fab
′
、(Fab')2、Fv、scFv、VH中的一种或几种。优选人源抗体或抗原结合片段。
[0016]本专利技术所述的EGFR抗体可以为通过现有技术获得的任何EGFR抗体，包括但不限于抗EGFR单抗、抗EGFR单链抗体、抗EGFR纳米抗体等。
[0017]本专利技术所述的HER2抗体可以为通过现有技术获得的任何HER2抗体，包括但不限于抗HER2单抗、抗HER2单链抗体、抗HER2纳米抗体等。
[0018]本专利技术一个具体的示例，所述EGFR抗体氨基酸序列如SEQ ID No:3所示,所述HER2抗体氨基酸序列如SEQ ID No:4所示。
[0019]本专利技术所述具有RGD基序的多肽，包括但不限于RGD、cRGD、iRGD，苯丙氨酸连接的RGD肽(F
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RGD)、丝氨酸连接的RGD肽(RGD
‑
S)、谷氨酸连接的RGD肽(G
‑
RGD)。本专利技术一个优选
的技术方案，含有RGD基序的多肽为iRGD，氨基酸序列如SEQ ID No：7所示。
[0020]本专利技术所述的连接肽(GGGGS)
n
，n代表1～50的整数，优选为n为2或3。
[0021]本专利技术所述蛋白1和/或蛋白2还可以进一步包含连接肽或类弹性蛋白，调节各功能片段之间的距离或者引入可修饰的位点。所述类弹性蛋白具有VPGXG组成的重复单元，各重复单元中X相同或者不同，X为除了脯氨酸之外的任意氨基酸，且至少有本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种拓扑结构星型蛋白，其特征在于由蛋白1和蛋白2经谍反应通过异肽键连接，所述蛋白1包括EGFR抗体或其抗原结合片段、具有RGD基序的多肽和谍标签，所述蛋白2包括HER2抗体或其抗原结合片段和谍捕手。2.根据权利要求1所述的星型蛋白，其特征在于所述谍标签的氨基酸序列如SEQ ID No：1所示，所述谍捕手的氨基酸序列如SEQ ID No：2所示。3.根据权利要求1所述的星型蛋白，其特征在于所述抗体是IgG1、IgG2、IgG3或IgG4形式的抗体，所述抗原结合片段为Fab、Fab'、(Fab')2、Fv、scFv、VH中的一种或几种。4.根据权利要求1所述的星型蛋白，其特征在于所述EGFR抗体氨基酸序列如SEQ ID No：3所示，所述HER2抗体氨基酸序列如SEQ ID No：4所示。5.根据权利要求1所述的星型蛋白，其特征在于所述蛋白1氨基酸序列如SEQ ID No：5所示，所述蛋白2氨基酸序列如SEQ ID No：6所示。6.一种多靶向抗体

【专利技术属性】
技术研发人员：蒋锡群，蒋蕙忆，陈伟芝，
申请(专利权)人：南京大学，
类型：发明
国别省市：