一种桑树硝酸还原酶、其核酸或基因在植物抗镁胁迫中的应用制造技术

本发明专利技术公开了一种桑树硝酸还原酶、其核酸或基因在植物抗镁胁迫中的应用。所述桑树硝酸还原酶的氨基酸序列如SEQ ID NO：2所示；所述核酸或基因的核苷酸序列如SEQ ID NO：1所示。本发明专利技术通过桑树在镁胁迫下相关生理生化指标的分析，以及桑树MmNIA基因的研究，利用亚细胞定位技术，推测该基因所表达的蛋白质位于细胞质，利用VIGS沉默技术，将桑树MmNIA基因转入根瘤农杆菌GV3101，利用病毒沉默原理减少基因的表达，观测转基因的抗逆能力降低，完善了桑树基因组并且提供了桑树在镁胁迫条件下的表达分析和应用。为研究桑树抗金属胁迫调控机制和培育新品种提供了重要的分子依据。培育新品种提供了重要的分子依据。培育新品种提供了重要的分子依据。

【技术实现步骤摘要】
一种桑树硝酸还原酶、其核酸或基因在植物抗镁胁迫中的应用


[0001]本专利技术属于植物基因工程领域，涉及一种桑树硝酸还原酶、其核酸或基因在植物抗镁胁迫中的应用。

技术介绍

[0002]桑树(Morus alba)属桑科，是一种多年生落叶乔本植物。我国是全世界桑种资源最丰富的国家，约占全世界桑种资源的80％。桑树因其具备较高的经济价值、药用价值、生态价值而被人们广泛种植。桑叶不仅可以被用作蚕食、茶饮，也可作为一种天然的植物染料；霜桑叶，具有疏风清热、润肺止咳、凉血止血的功效。桑根去栓皮可作药用，有宣肺平喘、消肿利尿的作用。桑葚不仅是一种营养价值极高的食用水果，还是食品行业的重要原料，如桑籽含油率约30.70％，可制作成食用油，而且桑籽油具有降脂功能和抗动脉粥样硬化作用。另外，桑树根系发达、分布面积较广、适应性强、耐寒、耐旱、耐盐碱、耐瘠薄土壤，是荒山造林的优良乡土树种之一。同时，桑树属于阔叶乔木，光合效率高、枝繁叶茂、固碳能力强，而且有较强的抗烟尘、有毒气体的能力，在碳汇储备和净化空气方面发挥重要的生态价值。近年来，我国蚕桑产业蓬勃发展，桑树具有有待开发和利用的未被认知的价值，完全可以实现全树资源全产业链利用，加快推进产业转型升级。
[0003]镁是植物生长必需元素中仅次于氮、磷、钾的第四大元素，是细胞中含量最多的游离二价阳离子。镁是叶绿素分子中存在的唯一金属元素，对稳定叶绿体结构发挥着至关重要的作用。镁因其具备较大的水合半径、较小的离子半径等特点，使之在众多的生理生化过程中不可或缺。镁离子是ATP的辅助因子，因而成为多种酶的活化剂，几乎所有的激酶和磷酸化酶都需要镁离子的活化；镁参与跨膜电子梯度和类囊体薄膜构象，参与能量代谢过程，促进光合作用的碳同化，具有稳定基因组的功能；镁也是核糖体的组成成分，同时它也是核糖体亚单位的的连接元素，在转录和翻译过程中发挥着重要的作用；此外，游离的镁离子不仅参与细胞的渗透调节作用，还能保持细胞膜的稳定性。因此，镁对作物的产量提高、品质的改善以及抗逆性的提升具有极其重要的作用。
[0004]我国幅员辽阔，土壤类型众多。但我国土壤中有效镁含量偏低，呈北高南低的分布趋势，土壤供镁能力低，大约有54％的土壤需要不同程度的补充镁肥。尤其是我国南方地区多处亚热带，气候温暖，雨量丰富，土壤侵蚀和淋洗程度高，供肥和保肥能力较弱，且南方地区红壤偏多，更易造成镁元素的流失。而且桑园普遍施用N、P、K肥，有机肥的施用量偏低，加之K
+
，Ca
2+
，H
+
、NH
4+
等离子会与镁离子发生拮抗作用。导致土壤中镁离子含量大量被消耗，最终使得桑树缺镁的现象经常在南方各地出现。相反，在我国北方，分布着大量的菱镁矿，矿区周围的土壤多为蛇纹石土壤，镁离子浓度非常高，易受镁毒害。目前，人们对缺镁的生理研究比较透彻，但对镁毒害所引起的生理机理却研究极少。

技术实现思路

[0005]专利技术目的：本专利技术的目的是提供了一种桑树硝酸还原酶、其核酸或基因在植物抗镁胁迫中的新应用。
[0006]技术方案：本专利技术所述的桑树硝酸还原酶、其核酸或基因在植物抗镁胁迫中的应用。
[0007]进一步地，所述桑树硝酸还原酶的氨基酸序列如SEQ ID NO：2所示。
[0008]进一步地，所述核酸或基因的核苷酸序列如SEQ ID NO：1所示。
[0009]进一步地，所述植物为桑树(Morus multicaulis)。
[0010]进一步地，所述镁胁迫条件为1mmol/L～9mmol/L浓度的MgSO4溶液。
[0011]进一步地，所述镁胁迫条件为1mmol/L、2mmol/L、3mmol/L、6mmol/L、9mmol/L浓度的MgSO4处理。
[0012]本专利技术所述的提高植物的抗镁胁迫能力的方法，使植物过表达或沉默表达桑树硝酸还原酶或含有桑树硝酸还原酶的核酸或基因。
[0013]本专利技术所述的鉴定植物是否具备有抗镁胁迫能力的方法，鉴定植物是否表达桑树硝酸还原酶或是否含有桑树硝酸还原酶的核酸或基因。
[0014]本专利技术所述的鉴定桑树的抗镁胁迫能力的分子标记物，所述的分子标记物为特异性识别上述桑树硝酸还原酶的编码基因的引物对。
[0015]进一步地，所述引物对如SEQ ID NO：3～4所示。
[0016]镁是叶绿素分子中存在的唯一金属元素，对稳定叶绿体结构发挥着至关重要的作用，多种酶的活化剂，桑树硝酸还原酶基因(MmNIA)参与植物的氮代谢途径，缺镁时，蛋白质合成受阻，蛋白质氮占总氮的比率下降。RNA聚合酶合力的产生需要Mg
2+
的激活，因此，缺镁时，RNA的合成将立即停止，蛋白质的合成也将随之下降，从而间接影响了氮素代谢。研究发现，在镁胁迫条件下，植物体内MDA含量、PRO含量、SOD活性、POD活性以及可溶性蛋白含量等均有变化；本申请实验结果也表明基因MmNIA在不同镁素浓度处理下表达水平明显不同。
[0017]有益效果：与现有技术相比，本专利技术具有如下突出的显著优点：本申请首次公开桑树硝酸还原酶基因MmNIA在抗镁胁迫中的应用，通过对基因MmNIA的研究，进一步了解镁在植物体内的吸收、运输和积累机制，发掘金属耐性或敏感性基因，最终通过基因工程方法改良植物的耐金属能力。对解决桑树缺镁和镁毒害问题提供了新思路，也为研究桑树抗金属胁迫调控机制和培育新品种提供了重要的分子依据。
附图说明
[0018]图1为桑树MmNIA基因克隆PCR图；其中M：5000bp DNA分子标记，1
‑
4泳道为PCR产物；
[0019]图2为定量RT
‑
PCR检测MmNIA基因在不同浓度MgSO4处理下桑苗嫩叶中的相对表达量图；
[0020]图3为桑苗在镁胁迫下超氧化物歧化酶(SOD)活性检测结果图；
[0021]图4为桑苗在镁胁迫下过氧化物酶(POD)活性检测结果图；
[0022]图5为桑苗在镁胁迫下过氧化氢酶(CAT)含量检测结果图；
[0023]图6为桑苗在镁胁迫下丙二醛(MDA)含量检测结果图；
RNase
‑
free ddH2O，13400g离心1min。测定提取物的A260/A280和A260/A230，确定RNA的纯度和浓度后，
‑
80
°
保存备用。
[0047]RNA不能作为PCR反应的模板，须将其反转录为cDNA。以提取总RNA4μL为模板，4
×
gDNAEraser Mix 4μL，RNase free H2O 8μL移液器轻轻吹打混匀，瞬时离心，无气泡，PCR仪42℃孵育2min后，在上一步的反应管中直接加入4μL 5
×
HiScript III qRT SuperMix，用移液器轻轻吹打混匀，瞬时离心，无气泡，PCR仪37℃反应15min。85℃反应5s，得到产物cDNA
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【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种桑树硝酸还原酶、其核酸或基因在植物抗镁胁迫中的应用。2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述桑树硝酸还原酶的氨基酸序列如SEQ ID NO：2所示。3.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述核酸或基因的核苷酸序列如SEQ ID NO：1所示。4.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述植物为桑树(Morus multicaulis)。5.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述镁胁迫条件为1mmol/L～9mmol/L浓度的MgSO4溶液。6.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述镁胁迫条件为1mmol/L、2mmol/L、...

【专利技术属性】
技术研发人员：赵卫国，金鑫，李浩男，李建宾，张翘楠，
申请(专利权)人：江苏科技大学，
类型：发明
国别省市：