反应管及其检测方法技术

本发明专利技术公开了一种反应管及其检测方法。所述反应管具有第一反应池和第二反应池，包括：管体、空气隔热结构、导流结构和进样结构。本发明专利技术的反应管可实现隔热和全封闭，避免了因频繁开盖添加试剂的步骤的同时避免污染，提高了检测准确性。本发明专利技术的反应管应用前景广阔，在学术研究领域及业界研发领域都会具有很大的应用空间，可应用于简单的生化或化学反应，乃至基于核酸或蛋白检测的病原快速诊断检测类型的IVD产品，具有巨大的市场价值。具有巨大的市场价值。具有巨大的市场价值。

【技术实现步骤摘要】
反应管及其检测方法


[0001]本专利技术涉及检测用品领域，具体是一种反应管及其检测方法。

技术介绍

[0002]近年来体外诊断(in vitro diagnosis，IVD)产品市场发展得如火如荼，中国市场规模2017年达到700亿人民币，同比增长15％左右。IVD产品下游的一个重要分支是POCT(point
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care testing，即即时检验)，2018年我国POCT占据整个体外诊断市场规模的11％，我国POCT市场增长迅速，年增长率能够达至20％～30％，远超全球7％～8％年增长水平。就分子诊断产品而言，技术门槛高，检测精确度要求高。而目前相对较成熟的分子检测产品均来自于国外，上述分子检测产品相对比较成熟，产品品质高，但价格昂贵；在国内，市场上还没有一款高品质的、性能可以与欧美市场上明星产品相媲美的分子检测平台。
[0003]CRISPR系统在学术界的应用甚为广泛，主要集中在其基因编辑功能，近年来随着该技术的不断发展以及新型CRISPR体系的开发，相继涌现出利用该技术的应用型产品。目前以利用Cas9、Cas12、Cas13和Cas14体系开发的应用产品为主。Cas12、Cas13和Cas14早前已有报道，例如张峰团队利用Cas13结合胶体金技术开发的SHERLOCK试纸条，可快速检测发病症状相似的寨卡病毒和登革热病毒；Doudna团队利用Cas12开发了DETECTOR，同样可用于病原的快速检测；Cas14则有相关报道利用其开发SNP检测的应用。上述提及的Cas12、Cas13和Cas14系统检测原理相似，Cas12、Cas13和Cas14结合特异性gRNA形成复合体，在gRNA的引导下，可特异性识别目标核酸序列(Cas12主要识别双链DNA，Cas13主要识别RNA，Cas14主要识别单链DNA)，并对目标核酸序列进行切割，对目标核酸序列的识别同时也触发其对周围的单链DNA或RNA的非特异性切割。利用该方法，研究者设计了单链DNA或RNA的报告探针，一端修饰淬灭基团，一端修饰荧光基团，以Cas12为例说明，首先目标双链DNA经过PCR扩增富集或RPA、LAMP、RCA等等温扩增富集后，与Cas12、gRNA及单链DNA检测探针混合，当Cas12/gRNA复合物特异性切割目标双链DNA序列后，则开始随机非特异性切割单链DNA探针，单链DNA探针被切断后，便发出荧光。后续利用荧光检测仪器进行读取，从而对检测目标核酸序列进行定性乃至定量检测。或者利用该CRISPR系统结合胶体金侧向层析的方法，进行试纸条显色，肉眼可见进行定性。常规检测方法均为非封闭系统。少有部分产品将该技术结合微流控系统将其作为全封闭体系，但成本高昂。该技术在病原快检领域有很广泛的应用空间，其特点为检测灵敏度高，特异性好。
[0004]但如上述该系列检测技术流程，作为开发快检产品存在的最大弊端就是扩增富集过程和CRISPR检测过程为两个独立的体系。首先，待检测目标片段扩增富集过程在一个体系中进行，扩增结束后取1
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2μL扩增产物加入到CRISPR检测体系中进行信号检测，此过程中需要将扩增富集产物开盖取样，极易产生气溶胶污染。例如，对于长期进行某种病原检测的专业实验室，长期的扩增反应及产生的气溶胶会对周围环境产生极大的污染，从而导致假阳性检测结果的产生。即便利用张峰和Doudna开发的CRISPR试纸条检测也避免不了扩增后开盖取样的步骤，避免不了气溶胶污染。此外，目标片段扩增富集后，取样分别加入到
CRISPR检测体系中，实验条件有限的实验室或者野外操作等情况，无法保证配备多道移液枪，当多样本共检时，不同样本不能同时开始CRISPR切割检测反应，致使起始荧光值无比较参考价值。即便可以利用多道移液枪进行不同检测样本同步加样，加样后转移至荧光读取装置前，也要保证检测体系在冰上放置避免检测前已发生切割反应，极大地限制了其便捷性。
[0005]此外，通常两个反应体系的反应温度不同，例如上述CRISPR快检目标片段富集扩增使用的常规PCR为变温过程，温度变化范围一般为50
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95℃。若为等温扩增，则温度范围一般为37
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65℃。而CRISPR检测体系反应温度在37
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48℃。为达到两个反应过程不开盖一管法检测的目的，单纯利用物理隔离两个反应体系无法有效地避免由于温度传导所导致的高温反应体系对低温检测体系性能的影响。
[0006]目前，无论是分子反应、生化反应乃至化学反应，都会有涉及到两个乃至多个反应体系的情况，有时还会涉及到如上述将两个独立的反应体系混合进行第三步反应的过程。另外一个应用例以RNA反转录过程为例，常规RNA反转录过程为RNA变性、逆转录一链合成和二链合成。第一步将RNA模板与引物混合，65℃5min后冰上冷却2min，开盖加入逆转录反应体系(buffer、dNTP、逆转录酶、RNase inhibitor)进行第二步反应。除上述CRISPR检测系统及RNA反转录过程外，化学反应中也常涉及到反应过程由两部分组成，后续两个部分需要全部或部分融合，或者实验过程中需要开盖填加额外试剂等情况，均存在操作时间长、样品污染及便捷性问题。
[0007]对于上述CRISPR快检技术，目前已有利用矿物油进行密封隔热的方法开发一管式检测体系，目标片段扩增富集反应一试剂置于管底，其上覆盖矿物油隔热，管顶部包埋反应二CRISPR检测试剂，待反应一结束后，试管颠倒混匀，将反应一与反应二试剂混合，从而实现不开盖一管式检测，根据测试结果显示，利用矿物油隔热能达到一定的隔热效果，但不是最佳。此外，利用该隔热方法，CRISPR检测体系使用体积以及检测样本使用体积均加倍，推测用于补偿热量影响CRISPR检测体系效果损耗及反应一与二混合时矿物油对于体系效果影响损耗。

技术实现思路

[0008]本专利技术所要解决的技术问题是为了克服现有分步检测技术中，两种反应温度不同的反应体系的反应相混合时步骤繁琐、易污染、耗时长的缺陷，提供一种反应管及其检测方法。本专利技术的反应管可实现隔热和全封闭，避免了因频繁开盖添加试剂的步骤的同时避免污染，提高了检测准确性。
[0009]本专利技术通过以下技术方案解决上述问题：
[0010]本专利技术的第一方面提供一种反应管，其具有第一反应池和第二反应池，所述反应管包括：管体、空气隔热结构、导流结构和进样结构；其中：
[0011]所述管体具有封闭的底部和开口的顶部；
[0012]所述空气隔热结构设置于所述管体内，所述第一反应池至少由所述空气隔热结构与所述管体的底部围成；
[0013]所述导流结构设置于所述管体内，所述导流结构贯穿所述空气隔热结构；
[0014]所述进样结构可拆卸地设置于所述管体的顶部或所述导流结构的顶部，所述进样
结构与所述导流结构通过薄膜隔开，所述薄膜设置于所述进样结构的底部或者所述导流结构内，所述第二反应池至少由所述进样结构与所述薄膜围成，所述进样结构能够本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种反应管，其具有第一反应池和第二反应池，其特征在于，包括：管体、空气隔热结构、导流结构和进样结构；其中：所述管体具有封闭的底部和开口的顶部；所述空气隔热结构设置于所述管体内，所述第一反应池至少由所述空气隔热结构与所述管体的底部围成；所述导流结构设置于所述管体内，所述导流结构贯穿所述空气隔热结构；所述进样结构设置于所述管体的顶部或所述导流结构的顶部，所述进样结构与所述导流结构通过薄膜隔开，所述薄膜设置于所述进样结构的底部或者所述导流结构内，所述第二反应池至少由所述进样结构与所述薄膜围成，所述进样结构能够改变所述第二反应池的内部容积或压力以使所述第二反应池通过所述导流结构与所述第一反应池单向连通。2.如权利要求1所述的反应管，其特征在于，所述空气隔热结构包括至少一个封闭的空腔，所述空腔与所述第一反应池及所述第二反应池均不连通。3.如权利要求1所述的反应管，其特征在于，所述导流结构与所述第一反应池连通的一端设置有单向阀门；所述单向阀门与所述空气隔热结构的底部平齐或低于所述空气隔热结构的底部。4.如权利要求1所述的反应管，其特征在于，所述薄膜由以下材料的其中一种制成：脆性树脂、玻璃、聚四氟乙烯及其衍生物。5.如权利要求1所述的反应管，其特征在于，所述空气隔热结构和所述导流结构形成一体式结构。6.如权利要求5所述的反应管，其特征在于，所述空气隔热结构和所述导流结构可拆卸地设置于所述管体内。7.如权利要求1所述的反应管，其特征在于，所述空气隔热结构与所述导流结构为分体式结构。8.如权利要求7所述的反应管，其特征在于，所述空气隔热结构、所述导流结构与所述管体为分体式结构。9.如权利要求1所述的反应管，其特征在于，所述管体、所述空气隔热结构和所述导流结构形成一体式结构。10.如权利要求1...

【专利技术属性】
技术研发人员：耿春雨，赵静，陈芳，刘健，蒋慧，
申请(专利权)人：深圳华大智造科技股份有限公司，
类型：发明
国别省市：