一种主动调控蛋白冠载药脂质体纳米材料的制备方法技术

本发明专利技术涉及纳米载药脂质体技术领域，具体为一种主动调控蛋白冠载药脂质体纳米材料的制备方法，所述方法包括以下步骤：S1、以卵磷脂、磷脂

【技术实现步骤摘要】
一种主动调控蛋白冠载药脂质体纳米材料的制备方法


[0001]本专利技术涉及纳米载药脂质体
，特别涉及一种主动调控蛋白冠载药脂质体纳米材料的制备方法。

技术介绍

[0002]目前，纳米载药技术已经运用临床药物开发。脂质体是由有序的具有细胞样结构的磷脂双分子层形成的脂囊泡，不仅可以很容易开发用于包埋亲水和离子分子，而且与疏水性药物兼容，是目前比较成熟的生物纳米材料。且由于其稳定的理化性质，显著的载药量，广泛运用于生物医药领域。但纳米材料(NPs)进入体内与生物分子形成的新纳米
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生物界面(通常称为纳米
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生物分子冠)是NPs的普适性现象，这种快速且不可避免的界面反应以不可预知的方式调控纳米材料的药理学和毒理学特征。NPs进入生物体内，被认为是外来物质，被单核吞噬系统(MPS，也称为网状内皮系统，RES)隔离、降解和消除，导致清除速度快、效率低、肝脏蓄积高。MPS真正看到的是NPs周围的蛋白质冠状物，而不是NPs本身最初预期的表面。不同的生物分子与纳米颗粒表面的结合模式导致不同的MPS摄取和血液循环时间。因此，表面配体与血液和免疫系统的相互作用作为纳米药物载体进入体内的第一步反应决定其在体内的生物分布、药效药代和安全性等这些在临床转化中的关键问题。
[0003]现有技术中针对抗动脉粥样硬化治疗的纳米药物载体效率低，不具备良好的主动靶向性，限制了药物的治疗效果。有鉴于此，提高针对抗动脉粥样硬化治疗的纳米药物载体的功效成为本领域急需解决的技术问题。

技术实现思路

>[0004]为实现上述目的，本专利技术提供了一种主动调控蛋白冠载药脂质体纳米材料的制备方法，所述方法包括以下步骤：
[0005]S1、以卵磷脂、磷脂
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甲氧基聚乙二醇
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羧基、胆固醇、佛司可林为原料制备负载阿托伐他汀的脂质体；
[0006]S2、将制得负载阿托伐他汀的脂质体与LDLR蛋白结合，得到偶联LDLR蛋白的载药脂质体。
[0007]优选地，步骤S1包括：
[0008]S11、将卵磷脂、磷脂
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甲氧基聚乙二醇
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羧基、胆固醇、佛司可林混合于离心管中，加入氯仿，超声充分溶解；
[0009]S12、将溶解后的反应液转移至100mL茄形瓶中，置于旋转蒸发仪上，旋蒸至氯仿完全挥发；
[0010]S13、将茄形瓶取下，加入纯化水进行水化反应；
[0011]S14、将茄形瓶取下，水浴超声至少1min后，将溶液取出至10mL离心管，探头超声至少9min；
[0012]S15、将溶液转移至100KD超滤管中，纯化水超滤洗涤至少5次；
[0013]S16、采用微孔滤膜过滤并用纯化水定容至第一目标体积，得到负载阿托伐他汀的脂质体。
[0014]优选地，步骤S11中卵磷脂、磷脂
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甲氧基聚乙二醇
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羧基、胆固醇、佛司可林的质量比为39：6：6：5。
[0015]优选地，制备负载阿托伐他汀的脂质体还包括荧光标记染料，所述荧光标记染料与卵磷脂、磷脂
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甲氧基聚乙二醇
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羧基、胆固醇、佛司可林的质量比为0.5：39：6：6：5。
[0016]优选地，所述荧光标记染料为Cy5染料。
[0017]优选地，旋蒸的温度为65
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75摄氏度，转速为25
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35r/min；水化反应的温度为35
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45℃，转速为15
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20r/min，时长为至少40min；探头超声在冰浴的条件下进行，超声功率为25
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30W，每超声2s后停3s。
[0018]优选地，所述微孔滤膜为0.22μm滤膜，第一目标体积为5
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10mL。
[0019]优选地，步骤S2包括：
[0020]S21、取负载阿托伐他汀的脂质体通过MES缓冲液洗涤并定容至第二目标体积；
[0021]S22、分别涡旋加入LDLR蛋白、1
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乙基
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(3
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二甲基氨基丙基)碳酰二亚胺，置于温度为35
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40℃、转速为100
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200r/min的摇床反应，反应时长大于20h；
[0022]S23、反应结束后，将反应液转移至100KD超滤管中，离心收集下清液，并采用纯化水超滤洗涤至少5次，上清液即为偶联LDLR蛋白的载药脂质体。
[0023]优选地，第二目标体积为8
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10mL，负载阿托伐他汀的脂质体与LDLR蛋白的质量比为10：1；1
‑
乙基
‑
(3
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二甲基氨基丙基)碳酰二亚胺的浓度为8
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10mg/mL，与第二目标体积的体积比为1：(8
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10)。
[0024]优选地，LDLR蛋白采用二甲基甲酰胺溶解后加入，1
‑
乙基
‑
(3
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二甲基氨基丙基)碳酰二亚胺采用MES溶液溶解后加入。
[0025]与现有技术相比，本专利技术的有益效果是：
[0026]本专利技术的实施方式提供的主动调控蛋白冠载药脂质体纳米材料的制备方法选择脂质体包载经典抗动脉粥样硬化药物阿托伐他汀，在脂质体表面设计修饰连接LDLR蛋白，制得偶联LDLR蛋白的载药脂质体，该利用偶联LDLR蛋白的载药脂质体可以LDLR蛋白与血液中的ApoB蛋白特异结合，具有出色的蛋白亲和力表现，从而实现纳米
‑
生物界面的精准主动调控，提高纳米药物靶向作用，为有效抗动脉粥样硬化治疗提供新的基础。
附图说明
[0027]图1为DLS测量偶联LDLR蛋白的载药脂质体的水合粒径、电势及电镜结果；
[0028]图2为HPLC检测阿托伐他汀样品的标准曲线；
[0029]图3为BCA检测LDLR蛋白与负载阿托伐他汀的脂质体的偶联结果；
[0030]图4为荧光分光光度计扫描Cy5染料的荧光光谱；
[0031]图5为不同浓度梯度下ApoB与Lip@A@L蛋白亲和力检测结果；
[0032]图6为细胞验证实验方法的细胞吞噬Confocal结果图；
[0033]图7为细胞验证实验方法的细胞油红染色图；
[0034]图8为细胞验证实验方法的CCK结果图；
[0035]图9为动物实验验证靶向作用方法的主动脉荧光成像图。
Receptor，LDLR)特异性结合。LDLR有五个结构区域，第一个区域包含低密度脂蛋白与相关脂蛋白的ApoB、ApoE的结合位点，它由7个40个氨基酸的同源重复序列组成，每个重复序列都富含半胱氨酸(LR1
‑
LR7)，其中LR5对LDLR的结合和释放非常重要。因此，本课题选择脂质体包载经典抗动脉粥样硬化药物阿托伐他本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种主动调控蛋白冠载药脂质体纳米材料的制备方法，其特征在于，所述方法包括以下步骤：S1、以卵磷脂、磷脂
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甲氧基聚乙二醇
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羧基、胆固醇、佛司可林为原料制备负载阿托伐他汀的脂质体；S2、将制得负载阿托伐他汀的脂质体与LDLR蛋白结合，得到偶联LDLR蛋白的载药脂质体。2.根据权利要求1所述的主动调控蛋白冠载药脂质体纳米材料的制备方法，其特征在于，步骤S1包括：S11、将卵磷脂、磷脂
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甲氧基聚乙二醇
‑
羧基、胆固醇、佛司可林混合于离心管中，加入氯仿，超声充分溶解；S12、将溶解后的反应液转移至100mL茄形瓶中，置于旋转蒸发仪上，旋蒸至氯仿完全挥发；S13、将茄形瓶取下，加入纯化水进行水化反应；S14、将茄形瓶取下，水浴超声至少1min后，将溶液取出至10mL离心管，探头超声至少9min；S15、将溶液转移至100KD超滤管中，纯化水超滤洗涤至少5次；S16、采用微孔滤膜过滤并用纯化水定容至第一目标体积，得到负载阿托伐他汀的脂质体。3.根据权利要求2所述的主动调控蛋白冠载药脂质体纳米材料的制备方法，其特征在于，步骤S11中卵磷脂、磷脂
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甲氧基聚乙二醇
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羧基、胆固醇、佛司可林的质量比为39：6：6：5。4.根据权利要求2所述的主动调控蛋白冠载药脂质体纳米材料的制备方法，其特征在于，制备负载阿托伐他汀的脂质体还包括荧光标记染料，所述荧光标记染料与卵磷脂、磷脂
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甲氧基聚乙二醇
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羧基、胆固醇、佛司可林的质量比为0.5：39：6：6：5。5.根据权利要求4所述的主动调控蛋白冠载药脂质体纳米材料的制备方法，其特征在于，所述荧光标记染料为Cy5染料。6.根据权利要求2所述的主动调控蛋白冠载药脂质体纳米材料的制备方法，其特征在于，旋蒸的温度为65
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75摄氏度，转速为25
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35r/m...

【专利技术属性】
技术研发人员：陈玲，陈春英，蔡绒，胡厚祥，
申请(专利权)人：川北医学院附属医院，
类型：发明
国别省市：