靶向CD19和GPRC5D配体的嵌合抗原受体及其应用制造技术

本发明专利技术实施例公开了一种靶向CD19和GPRC5D配体的嵌合抗原受体及其应用。本发明专利技术提供的GPRC5D

【技术实现步骤摘要】
靶向CD19和GPRC5D配体的嵌合抗原受体及其应用


[0001]本专利技术实施例涉及肿瘤药物
，具体涉及一种靶向CD19和GPRC5D配体的嵌合抗原受体及其应用。

技术介绍

[0002]多发性骨髓瘤(MM)是一种克隆性浆细胞异常增殖的恶性疾病，发病率正逐年增高。几十年来，多发性骨髓瘤的治疗出现了大量新进展，包括蛋白酶体抑制剂、免疫调节药物、单克隆抗体等，显著延长了患者生存，但目前尚无法根治，几乎所有的患者最终会进入疾病的复发难治阶段。针对这部分患者，目前仍存在大量未被满足的治疗需求。
[0003]嵌合抗原受体T(CAR
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T)细胞是近年来新兴的细胞免疫治疗手段。采用患者本身的T淋巴细胞，在体外通过病毒转染的方法，将针对肿瘤靶点的CAR分子整合到T细胞中从而制备CAR
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T细胞。靶向B细胞成熟抗原(BCMA)的CAR
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T细胞在难治复发多发性骨髓瘤中取得了重要突破，为这部分患者带来了生存的新希望，目前国外已有两款BCMACAR
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T细胞产品获批上市。黄河教授团队于2021年发表于Clinicalcancerresearch的论文总结了BCMA CAR
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T细胞治疗难治复发多发性骨髓瘤的临床数据，总体反应率98.3％，完全缓解率70.3％。但仍有约60％的患者面临疾病的复发，复发后预后极差，缺乏有效的治疗手段。因此亟需寻找有效的免疫治疗新靶点，这也是目前全球该领域的研究热点。

技术实现思路

[0004]本专利技术是基于专利技术人对以下事实和问题的发现和认识做出的：
[0005]GPRC5D(Gprotein
‑
coupledreceptorclassCgroup5memberD)是G蛋白偶联受体家族C组5成员D，其是一种G蛋白偶联孤儿受体，并且是7次跨膜的膜蛋白。在CCLE数据库中分析多发性骨髓瘤细胞中高表达GPRC5D(见图1)。研究表明，GPRC5D主要是在浆细胞中表达，包括大部分来自MM患者的恶性浆细胞。在MM患者中，GPRC5DmRNA的表达量与浆细胞负荷和基因畸变相关，而在正常组织中，其仅在表达硬角蛋白的细胞如毛囊中有表达。GPRC5D的过表达与多发性骨髓瘤患者的不良预后和肿瘤负荷有关，这种关联使其成为治疗多发性骨髓瘤的潜在候选靶点。此外，GPRC5D与BCMA独立表达，不具有相关性；联合靶向BCMA和GPRC5D已被证明可以防止BCMA逃逸的复发，可以发挥互补效应或者开发双抗、双靶点CAR
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T等。
[0006]一小部分MM细胞克隆可能表达CD19，这被认为是低分化的MM细胞或骨髓瘤样干细胞。针对该亚组的疗法可能与传统的骨髓瘤疗法具有协同作用。抗CD19CART细胞联合自体干细胞移植(ASCT)在R/RMM患者中也显示出潜在活性。此外，通过应用超分辨率显微镜，CD19在大多数患者的一小部分骨髓瘤细胞上以超低密度表达，每个骨髓瘤细胞的超低CD19分子可以触发抗CD19CART细胞的消除。
[0007]鉴于CD19和GPRC5D配体参与到多发性骨髓瘤的发生及进展过程，都可作为治疗多种癌症的良好靶点。为此，本专利技术构建了可同时靶向CD19和GPRC5D配体的双特异性CAR结构，经改造后的抗CD19和GPRC5D配体双靶点CAR
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T细胞可专一性、高效杀灭肿瘤细胞，可以
对肿瘤更有效和全面的覆盖，以消除绝大部分多发性骨髓瘤细胞，降低肿瘤复发的风险。
[0008]根据本专利技术实施例第一方面，本专利技术提供一种靶向CD19和GPRC5D配体的嵌合抗原受体，所述嵌合抗原受体包括：抗原结合结构域、铰链区、跨膜结构域和胞内结构域，其中，所述抗原结合结构域包括抗CD19scFv和抗GPRC5DscFv，所述抗CD19scFv氨基酸序列如SEQ ID NO:1所示，所述抗GPRC5DscFv氨基酸序列如SEQ ID NO:2所示。
[0009]进一步地，所述铰链区为CD8铰链区；所述跨膜结构域为CD8跨膜结构域；所述胞内结构域包括4
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1BB胞内区和CD3ζ胞内区。
[0010]进一步地，所述嵌合抗原受体的氨基酸序列如SEQ ID NO:3所示。
[0011]根据本专利技术实施例第二方面，本专利技术提供用于编码如上所述的嵌合抗原受体的核酸分子。
[0012]进一步地，所述核酸分子包括：编码抗CD19scFv的如SEQ ID NO:4所示的核苷酸序列，和；编码抗GPRC5DscFv的如SEQ ID NO:5所示的核苷酸序列。
[0013]根据本专利技术实施例第三方面，本专利技术提供一种重组表达载体，含有如上所述的核酸分子。
[0014]进一步地，其核苷酸序列如SEQ ID NO:6所示。
[0015]根据本专利技术实施例第四方面，本专利技术提供一种靶向CD19和GPRC5D配体的嵌合抗原受体T细胞，其表达有如上所述的嵌合抗原受体。
[0016]根据本专利技术实施例第五方面，本专利技术提供如上所述的嵌合抗原受体、如上所述的核酸分子、如上所述的重组表达载体，或如上所述的嵌合抗原受体T细胞在制备治疗多发性骨髓瘤药物中的应用。
[0017]本专利技术实施例具有以下优点：
[0018]本专利技术提供的GPRC5D
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CD19
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CAR
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T双特异性CAR
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T能同时识别GPRC5D和CD19抗原，相比单靶点CAR
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T，双特异性CAR
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T的杀伤能力更强，能够有效清除CD19和GPRC5D配体单/双阳性肿瘤细胞，减少抗原逃逸，在多发性骨髓瘤的治疗中具有极大的临床转化价值。
附图说明
[0019]为了更清楚地说明本专利技术的实施方式或现有技术中的技术方案，下面将对实施方式或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍。显而易见地，下面描述中的附图仅仅是示例性的，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据提供的附图引伸获得其它的实施附图。
[0020]图1为本专利技术提供的在CCLE数据库中分析多发性骨髓瘤细胞中GPRC5D配体的表达情况；
[0021]图2为本专利技术提供的CD19
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GPRC5D
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CAR的结构示意图；
[0022]图3为本专利技术提供的CD19
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CAR的结构示意图；
[0023]图4为本专利技术提供的GPRC5D
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CAR的结构示意图；
[0024]图5为本专利技术提供的慢病毒CD19
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GPRC5D
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CAR载体的酶切片段的电泳鉴定图；
[0025]图6为本专利技术提供的慢病毒CD19
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CAR载体的酶切片段的电泳鉴定图；
[0026]图7为本专利技术提供的慢病毒GPRC5D
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CAR载体的酶切本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种靶向CD19和GPRC5D配体的嵌合抗原受体，其特征在于，所述嵌合抗原受体包括：抗原结合结构域、铰链区、跨膜结构域和胞内结构域，其中，所述抗原结合结构域包括抗CD19scFv和抗GPRC5DscFv，所述抗CD19scFv氨基酸序列如SEQ ID NO:1所示，所述抗GPRC5DscFv氨基酸序列如SEQ ID NO:2所示。2.根据权利要求1所述的靶向CD19和GPRC5D配体的嵌合抗原受体，其特征在于，所述铰链区为CD8铰链区；所述跨膜结构域为CD8跨膜结构域；所述胞内结构域包括4
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1BB胞内区和CD3ζ胞内区。3.根据权利要求1所述的靶向CD19和GPRC5D配体的嵌合抗原受体，其特征在于，所述嵌合抗原受体的氨基酸序列如SEQ ID NO:3所示。4....

【专利技术属性】
技术研发人员：阴钊，张青，刘爽，欧瑞明，
申请(专利权)人：广东省第二人民医院广东省卫生应急医院，
类型：发明
国别省市：