稳定的冠状病毒蛋白及其疫苗组合物制造技术

本文提供了组合物和方法，所述组合物和方法包含突变的冠状病毒“S”刺突蛋白或其受体结合结构域，在相同的表达、培养或储存条件下，所述突变的冠状病毒“S”刺突蛋白或其受体结合结构域与其相对应的天然或野生型冠状病毒刺突蛋白相比具有增加的表达水平、产率和稳定性。这些突变的刺突蛋白可用于产生针对一种或多种冠状病毒的基于蛋白质的疫苗。种冠状病毒的基于蛋白质的疫苗。种冠状病毒的基于蛋白质的疫苗。

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】稳定的冠状病毒蛋白及其疫苗组合物
[0001]政府支持
[0002]本专利技术根据国立卫生研究院(National Institutes of Health)授予的AI141707在政府支持下产生。政府对本专利技术具有一定权利。
[0003]相关申请的交叉引用
[0004]本申请根据35U.S.C.
§
119(e)要求于2020年12月31日提交的美国临时申请号63/132,863和于2021年5月14日提交的美国临时申请号63/188,651的权益，所述美国临时申请中的每一者的内容通过引用方式以其整体并入本文。


[0005]本专利技术的领域涉及用于提高基于蛋白质的疫苗的稳定性的方法和组合物。

技术介绍

[0006]冠状病毒仍然是突出的大流行威胁，其中由SARS
‑
CoV
‑
2病毒诱发的2019/2020大流行导致全球数十万人死亡并且经济大幅放缓。即使在当前的大流行减弱之后，SARS
‑
CoV
‑
2也可能会维持持续流行。因此，非常需要针对SARS
‑
CoV
‑
2或其他未来出现的冠状病毒的有效疫苗。

技术实现思路

[0007]本文所述的组合物和方法部分地基于SARS
‑
CoV
‑
2S“刺突”蛋白氨基酸序列中的提高所表达的蛋白质的产量和稳定性两者(在相同或相似的培养条件下)的单个或成对的氨基酸突变的发现。这种增强的刺突蛋白(在本文中也被称为“刺突蛋白衍生的抗原”)稳定性允许生产比基于野生型或天然蛋白的疫苗具有更长保质期(在相同或类似储存条件下)的疫苗。
[0008]因此，在一个方面中，本文提供了一种非天然存在的多肽，所述非天然存在的多肽包含第一冠状病毒受体结合结构域(RBD)，所述第一冠状病毒RBD包含与SEQ ID NO:1的残基328
‑
531至少90％的同一性，并且进一步包含相对于SEQ ID NO:1的RBD的至少两个突变，其中所述至少两个突变选自由以下组成的组：F338L/Y365W；Y365W/L513M；Y365W/F392W；F338M/A363L/Y365F/F377V；Y365F/F392W；Y365F/V395I；Y365F/F392W/V395I；Y365W/L513I/F515L；F338L/A363L/Y365M；F338L/I358F/Y365W；I358F/Y365W/L513M；I358F/Y365W/F392W；F338M/I358F/A363L/Y365F/F377V；I358F/Y365F/F392W；I358F/Y365F/V395I；I358F/Y365F/F392W/V395I；I358F/Y365W/L513I/F515L；和F338L/I358F/A363L/Y365M，或在如通过使用Blast
‑
p(Altschul,S.F.,Gish,W.,Miller,W.,Myers,E.W.&Lipman,D.J.(1990)"Basic local alignment search tool."J.Mol.Biol.215:403
‑
410)将SEQ ID NO:1与第二冠状病毒受体结合结构域的序列进行序列比对所确定的第二冠状病毒受体结合结构域的对应残基处。在一个实施方案中，所使用的Blast
‑
p程序是国家生物技术信息中心(NCBI)在线比对工具。或者，可以将Blast
‑
p程序下载到设备上并在本地使用。
本领域的技术人员将很容易理解Blast
‑
p比对工具的使用，然而为了避免疑义，随本文提供协议1和协议2以分别用于在线和下载的比对工具。
[0009]协议1：用于与来自国家生物技术信息中心(NCBI)服务器的在线BLASTp比对一起使用。
[0010]1.使用以下设置来设置BLAST比对：
[0011]使用“Align two or more sequences(比对两个或更多个序列)”选项
[0012]向“Enter Query Sequence(输入查询序列)”区段中输入相关SARS
‑
CoV
‑
2蛋白的参考株序列(即，SEQ ID NO:1)
[0013]向“Enter Subject Sequence(输入主题序列)”区段中输入任何对应的冠状病毒刺突蛋白序列
[0014]算法：blastp(蛋白质
‑
蛋白质BLAST)
[0015]预期阈值：0.1
[0016]字长：6
[0017]查询范围内的最大匹配：0
[0018]矩阵：BLOSUM62
[0019]空位成本：
[0020]存在：11
[0021]延伸：1
[0022]过滤低复杂度区域？：否
[0023]掩码：
[0024]仅用于查找表？：否
[0025]小写字母？：否。
[0026]2.通过点击“BLAST”按钮运行分析。
[0027]3.点击“Alignments(比对)”标记以显示两个序列之间的比对。
[0028]4.对于每个感兴趣的序列位置，根据“Query(查询)”序列鉴定编号。然后鉴定已与“Query(查询)”序列的位置比对的“Sbjct”序列中的对应残基位置。
[0029]协议2：用于与下载到本地计算机或服务器上的蛋白质BLASTp比对工具一起使用。
[0030]1.使用制造商的使用说明安装BLAST以执行命令行，或确定已安装BLAST的计算机或服务器。
[0031]2.生成FASTA格式的文件，该文件包含所需的SARS
‑
CoV
‑
2蛋白亚型特异性参考菌株(即，SEQ ID NO:1)。在以下命令中，这个文件将被命名为“query.fasta”。
[0032]3.生成FASTA格式的第二文件，该第二文件包含来自同一亚型的不同冠状病毒的对应蛋白质序列。在以下命令中，这个文件将被命名为“sbjct.fasta”。
[0033]4.使用诸如Terminal、iTerm2、Windows Console、Linux console或其他类似终端仿真器的程序执行以下命令。这将在名为“results.txt”的文件中生成结果。blastp
‑
查询query.fasta
‑
主题sbjct.fasta
‑
矩阵BLOSUM62
‑
evalue 0.1
‑
[0034]字长6
‑
空位打开11
‑
空位延伸1
‑
输出results.txt
[0035](blastp
‑
本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】1.一种非天然存在的多肽，所述非天然存在的多肽包含第一冠状病毒受体结合结构域(RBD)，所述第一冠状病毒RBD包含与SEQ ID NO:1的残基328
‑
531至少90％的同一性，并且进一步包含相对于SEQ ID NO:1的RBD的至少两个突变，其中所述至少两个突变选自由以下组成的组：F338L/Y365W；Y365W/L513M；Y365W/F392W；F338M/A363L/Y365F/F377V；Y365F/F392W；Y365F/V395I；Y365F/F392W/V395I；Y365W/L513I/F515L；F338L/A363L/Y365M；F338L/I358F/Y365W；I358F/Y365W/L513M；I358F/Y365W/F392W；F338M/I358F/A363L/Y365F/F377V；I358F/Y365F/F392W；I358F/Y365F/V395I；I358F/Y365F/F392W/V395I；I358F/Y365W/L513I/F515L；和F338L/I358F/A363L/Y365M或在如通过使用协议1或协议2的Blast
‑
p参数将SEQ ID NO:1与第二冠状病毒受体结合结构域的序列进行序列比对所确定的所述第二冠状病毒受体结合结构域的对应残基处。2.一种非天然存在的多肽，所述非天然存在的多肽包含：第一冠状病毒受体结合结构域(RBD)，所述第一冠状病毒RBD包含与SEQ ID NO:1的残基328
‑
531或与如通过使用协议1或协议2的Blast
‑
p参数将SEQ ID NO:1与第二冠状病毒受体结合结构域的序列进行序列比对所确定的所述第二冠状病毒的所述受体结合结构域的对应残基的至少90％的同一性，并且进一步包含相对于SEQ ID NO:1的所述RBD或所述第二冠状病毒中的所述对应残基的至少两个突变，其中相对于缺乏所述至少两个突变的野生型多肽的稳定性，所述至少两个突变增强了所述多肽的稳定性。3.根据权利要求2所述的多肽，其中所述至少两个突变在SEQ ID NO:1的以下氨基酸处：338和365；365和513；365和392；338、363、365和377；
365和392；365和395；365、392和395；365、513和515；338、363和365；338、358和365；358、365和513；358、365和392；338、358、363、365和377；358、365和392；358、365和395；358、365、392和395；358、365、513和515；和/或338、358、363和365，或在如通过使用协议1或协议2的Blast
‑
p参数将SEQ ID NO:1与所述第二冠状病毒受体结合结构域的所述序列进行序列比对所确定的所述第二冠状病毒受体结合结构域的对应残基处。4.根据权利要求2或3所述的多肽，其中所述至少两个突变选自由以下组成的组：SEQ ID NO:1的F338L/Y365W；Y365W/L513M；Y365W/F392W；F338M/A363L/Y365F/F377V；Y365F/F392W；Y365F/V395I；Y365F/F392W/V395I；Y365W/L513I/F515L；F338L/A363L/Y365M；F338L/I358F/Y365W；I358F/Y365W/L513M；I358F/Y365W/F392W；F338M/I358F/A363L/Y365F/F377V；I358F/Y365F/F392W；I358F/Y365F/V395I；I358F/Y365F/F392W/V395I；I358F/Y365W/L513I/F515L；和F338L/I358F/A363L/Y365M，或在如通过使用协议1或协议2的Blast
‑
p参数将SEQ ID NO:1与所述第二冠状病毒受体结合结构域的所述序列进行序列比对所确定的第二冠状病毒的对应残基处。5.根据权利要求2
‑
4中任一项所述的多肽，所述多肽进一步包含SEQ ID NO:1的所述
RBD之外的附加氨基酸残基。6.根据权利要求2
‑
5中任一项所述的多肽，其中所述冠状病毒受体结合结构域(RBD)包含与SEQ ID NO:1的残基328
‑
531至少95％的同一性。7.根据权利要求2
‑
6中任一项所述的多肽，其中在SEQ ID NO:1的以下氨基酸处338和365；365和513；365和392；338、363、365和377；365和392；365和395；365、392和395；365、513和515；338、363和365；338、358和365；358、365和513；358、365和392；338、358、363、365和377；358、365和392；358、365和395；358、365、392和395；358、365、513和515；和/或338、358、363和365，或在所述第二冠状病毒受体结合结构域的对应残基处的所述至少两个突变是在所述受体结合结构域中相对于野生型的唯一突变。8.根据权利要求2
‑
7中任一项所述的多肽，其中当在细胞中表达时，所述RBD多肽的表达与缺乏所述至少两个突变的所述野生型RBD多肽的表达相比增多。9.根据权利要求2
‑
8中任一项所述的多肽，其中所述RBD多肽结合冠状病毒抗体或结合冠状病毒同源受体。10.根据权利要求9所述的多肽，其中所述冠状病毒抗体包括SARS
‑
CoV
‑
2抗体。11.根据权利要求9所述的多肽，其中针对与所述多肽对应的所述冠状病毒的所述受体包括血管紧张素转换酶(ACE)受体。12.根据权利要求11所述的多肽，其中所述ACE受体是ACE2受体。13.根据权利要求2
‑
12中任一项所述的多肽，其中所述第二冠状病毒包含选自以下的冠状病毒的序列：严重急性呼吸综合征相关冠状病毒2(SARS
‑
CoV
‑
2)、严重急性呼吸综合征相关冠状病毒(SARS
‑
CoV)；中东呼吸综合征(MERS)；229E；NL63；OC43；或HKU1。14.根据权利要求2
‑
13中任一项所述的多肽，其中所述多肽包含与SEQ ID NO:1至少90％的序列同一性。15.根据权利要求2
‑
14中任一项所述的多肽，其中所述RBD融合至第二异源多肽。16.根据权利要求15所述的多肽，其中所述RBD融合至纳米粒子、纳米结构或异源蛋白
质支架。17.根据权利要求2
‑
16中任一项所述的多肽，其中所述RBD多肽和/或所述第二多肽是抗原性多肽。18.一种组合物，所述组合物包含根据权利要求1
‑
17中任一项所述的多肽和药学上可接受的载体。19.根据权利要求18所述的组合物，所述组合物进一步包含佐剂。20.根据权利要求18或19所述的组合物，其中所述组合物的保质期比包含缺乏所述至少两个突变的野生型RBD多肽的组合物更长。21.根据权利要求18
‑
20中任一项所述的组合物，其中所述组合物被配制为疫苗。22.一种包含至少两个突变的非天然存在的冠状病毒刺突蛋白亚基1多肽，其中所述至少两个突变包括至少一个空腔填充突变和至少一个第二突变。23.根据权利要求22所述的冠状病毒多肽，其中相对于缺乏所述至少一个空腔填充突变和所述至少第二突变的野生型多肽的稳定性，所述至少两个突变增强了所述冠状病毒多肽的稳定性。24.根据权利要求22或23所述的冠状病毒多肽，其中所述至少一个空腔填充突变包括所述冠状病毒刺突蛋白亚基1的亚油酸结合袋中的残基的突变。25.根据权利要求22
‑
24中任一项所述的冠状病毒多肽，其中所述至少一个空腔填充突变包括在SEQ ID NO:1的残基328
‑
531内的残基的突变，或在如通过使用协议1或协议2的Blast
‑
p参数将SEQ ID NO:1与第二冠状病毒刺突蛋白亚基1的序列进行序列比对所确定的所述第二冠状病毒刺突蛋白亚基1的对应残基处的突变。26.根据权利要求22
‑
25中任一项所述的冠状病毒多肽，其中所述至少一个空腔填充突变包括SEQ ID NO:1的在残基335
‑
345、355
‑
375、或378
‑
395之间的残基的突变，或在如通过使用协议1或协议2的Blast
‑
p参数将SEQ ID NO:1与第二冠状病毒刺突蛋白亚基1的序列进行序列比对所确定的所述第二冠状病毒刺突蛋白亚基1的对应残基处的突变。27.根据权利要求22
‑
26中任一项所述的冠状病毒多肽，其中所述至少一个空腔填充突变包括SEQ ID NO:1的在氨基酸336、338、341、342、358、361、363、365、368、374、377、387或392处的残基的突变，或如通过使用协议1或协议2的Blast
‑
p参数将SEQ ID NO:1与所述第二冠状病毒的所述序列进行序列比对所确定的第二冠状病毒刺突蛋白亚基1的对应残基的突变。28.根据权利要求22
‑
27中任一项所述的冠状病毒多肽，其中所述至少一个空腔填充突变和所述至少一个第二突变在SEQ ID NO:1的以下残基处338和365；365和513；365和392；338、363、365和377；365和392；365和395；365、392和395；365、513和515；
338、363和365；338、358和365；358、365和513；358、365和392；338、358、363、365和377；358、365和392；358、365和395；358、365、392和395；3...

【专利技术属性】
技术研发人员：D，
申请(专利权)人：弗雷德哈钦森癌症中心，
类型：发明
国别省市：