一种有效以反义寡核苷酸为基础的抗登革病毒的核酸靶点及其应用制造技术

本发明专利技术公开了一种有效以反义寡核苷酸为基础的抗登革病毒的核酸靶点及其应用。本发明专利技术属于基因工程技术领域,涉及一种有效以反义寡核苷酸为基础的抗登革病毒的核酸靶点及其应用。本发明专利技术的反义寡核苷酸是SEQ ID No.1所示单链RNA分子、该单链RNA分子及其修饰物、或其药学上可接受的盐，可直接靶向登革病毒核酸，特异性降解和沉默靶基因，使病毒失去复制能力，具有效率高、特异性强、可编程特点，且不易产生传统抗病毒药物所产生的耐药性，作为一种新的抗病毒药物具有广泛的应用前景。新的抗病毒药物具有广泛的应用前景。

【技术实现步骤摘要】
一种有效以反义寡核苷酸为基础的抗登革病毒的核酸靶点及其应用


[0001]本专利技术属于基因工程
,涉及一种有效以反义寡核苷酸为基础的抗登革病毒的核酸靶点及其应用。

技术介绍

[0002]登革病毒(dengue virus)属黄病毒科黄病毒属，为有包膜的单股正链RNA病毒，依其抗原性不同可分为四种血清型(DENV
‑1‑
4)。其基因组由约11kb的RNA组成。该RNA被翻译成多个蛋白，编码三种结构蛋白和七种非结构蛋白，三种结构蛋白即衣壳(C)、膜前(PrM)、包膜(E)，七种非结构蛋白即NS1、NS2a、NS2b、NS3、NS4a、NS4b和NS5基因蛋白。成熟的登革病毒三维图像重建显示，它的直径约为50nm，由一个蛋白质外壳(E和M)、一个脂质双层结构和一个特征不太明显的衣壳核心(C和RNA基因组)组成。
[0003]登革病毒经雌蚊叮咬传播，主要是埃及伊蚊和白纹伊蚊，可引起人类登革热以及重症登革(Sever Dengue，SD)。每年大约有3.9亿人感染DENV，波及128个国家，以美洲、东南亚、西太平洋地区最为严重，其中DENV
‑
2型传播最为广泛，而我国则主要流行DENV
‑
1型。世界卫生组织(WHO)将登革热视为热带及亚热带地区的重大公共卫生问题。目前全世界约有25亿人受到登革热感染的威胁，其发病率呈上升趋势，成为这些地区重要的公共卫生问题。由于至今仍无安全有效的登革疫苗用于临床，登革热流行的控制仍有赖于蚊媒的控制，蚊媒控制技术的研究、应用与发展成为了登革热流行控制的重要组成部分。登革病毒于变异较快，发病较急，且目前尚无针对登革病毒的特效药物。
[0004]反义寡核苷酸(antisense oligonucleotide，ASO)为化学合成的单链核苷酸分子，通常为13
‑
30个核酸序列的短片段(故称为“寡核苷酸”)，这一核酸序列被设计成为与靶向基因序列互补(故称为“反义”)，通过沃森－克里克(Watson
‑
Crick)碱基配对的方式与特异的RNA序列结合,从而达到沉默与抑制基因表达的目的。在生物信息学指导下通过精心设计，使该核苷酸片段对目标RNA具有高度的特异性，从而达到基因靶向治疗的目的。
[0005]反义寡核苷酸沉默基因表达的机制共分为两种，一种为仅占位机制，即寡核苷酸仅与基因片段结合但是不产生变构效应。第二种为降解机制，此种机制主要发生在寡核苷酸与基因转录产物mRNA结合的过程中，为比较常见的作用机制。目前已经有几种反义寡核苷酸通过了FDA认证，并还有几种反义寡核苷酸进行三期临床实验。
[0006]诺西钠生是第一个用于治疗临床所有类型的SMA(脊髓性肌萎缩症)患者的反义核苷酸药物。该药含有18个核苷酸序列，与SMN2的内含子7中的一段序列(ISS
‑
N1)进行互补结合，从而增强外显子7的剪接及其后续的功能性SMN蛋白的合成。自2016年获得FDA批准后，该药目前已经在世界多个国家获得批准上市。
[0007]反义寡核苷酸药物相比于其他药物的优势主要有：合成技术成熟，安全性有保障和体内稳定性好。然而，目前尚无针对登革病毒的反义寡核苷酸药物，目前的反义寡核苷酸药物靶点筛选技术存在很大的困难，利用计算机筛选靶点药物存在造价高，效率低，靶向性
差等缺点，因此，急需为抗病毒反义寡核苷酸药物提供有效靶点。

技术实现思路

[0008]本专利技术所要解决的技术问题是如何抑制登革病毒。
[0009]为解决上述技术问题，本专利技术首先提供了单链RNA分子、其修饰物、或其药学上可接受的盐，所述单链RNA分子为序列为序列表中SEQ ID No.1所示RNA分子。
[0010]其中，SEQ ID No.1由28个核糖核苷酸组成，所述单链RNA分子与2型登革病毒的3
’
UTR区域核苷酸序列第10608
‑
10636位的靶序列相同。(因登革病毒基因组的相似性，该靶点所对应的核苷酸序列不仅限于2型登革病毒，适用于所有型别的登革病毒)。
[0011]所述2型登革病毒的3
’
UTR区域核苷酸序列为5
’‑
AAACAAAAAACAGCATATTGACGCTGGGA
‑3’
(序列表中序列12)。
[0012]术语“修饰物”是指对所述单链RNA分子进行修饰得到的产物，各种修饰方法均可选用，包括选自核糖修饰、碱基修饰和磷酸骨架修饰中的一种或几种的组合等。术语“药学上可接受的盐”指在可靠的医学判断范围内，适合用于与人类和低等动物的组织接触而不出现过度的毒性、刺激、过敏反应等，且与合理的效果/风险比相称的盐。药学可接受的盐是本领域公知的。例如，S.M.Berge,et al.,J.Pharmaceutical Sciences,1977,66:1中对药学可接受的盐进行了详细描述。
[0013]所述修饰物可为将所述单链RNA分子的每个核苷酸进行吗啉代修饰得到的化合物。所述吗啉代修饰为将核糖核酸通过碱基互补配对原则与碱基相连，该碱基与吗啉代环的5位碳原子相连，吗啉代环的1位碳原子与二氨基磷酸酯基团(图1中R1为二氨基磷酸酯基团)连接，吗啉代环的3位N原子与另一个二氨基磷酸酯基团的磷原子连接(图1中R2为吗啉代环)，具体如图1所示，使得靶点序列两端呈现出树杈状结构，从而增加反义寡核苷酸进入细胞的转染效率。
[0014]下述B1)
‑
B12)所示的与所述单链RNA分子相关的生物材料也属于本专利技术的保护范围：B1)编码权利要求1中所述单链RNA分子的DNA分子；
[0015]B2)含有B1)所述DNA分子的表达盒；
[0016]B3)含有B1)所述DNA分子的重组载体；
[0017]B4)含有B2)所述表达盒的重组载体；
[0018]B5)含有B1)所述DNA分子的重组微生物；
[0019]B6)含有B2)所述表达盒的重组微生物；
[0020]B7)含有B3)所述重组载体的重组微生物；
[0021]B8)含有B4)所述重组载体的重组微生物；
[0022]B9)含有B1)所述DNA分子的转基因动物细胞系；
[0023]B10)含有B2)所述表达盒的转基因动物细胞系；
[0024]B11)含有B3)所述重组载体的转基因动物细胞系；
[0025]B12)含有B4)所述重组载体的转基因动物细胞系；
[0026]B13)含有B1)所述DNA分子的转基因植物细胞系。
[0027]为解决上述技术问题，本专利技术还提供登革病毒抑制剂和预防或/和治疗登革病毒感染的药物。
[0028]本专利技术所提供的登革病毒抑制剂，含有前文所述的单链RNA分子、其修饰物、或其药学上可接受的盐。
[0029]本专利技术所提供的预防或/和治疗登革病毒感染的药物，含有前文所述的单链RNA分子、其修饰物、或其药学上本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.单链RNA分子、其修饰物、或其药学上可接受的盐，其特征在于：所述单链RNA分子为序列为序列表中SEQ ID No.1所示RNA分子。2.与权利要求1中所述单链RNA分子相关的生物材料，为下述中的任一种：B1)编码权利要求1中所述单链RNA分子的DNA分子；B2)含有B1)所述DNA分子的表达盒；B3)含有B1)所述DNA分子的重组载体；B4)含有B2)所述表达盒的重组载体；B5)含有B1)所述DNA分子的重组微生物；B6)含有B2)所述表达盒的重组微生物；B7)含有B3)所述重组载体的重组微生物；B8)含有B4)所述重组载体的重组微生物；B9)含有B1)所述DNA分子的转基因动物细胞系；B10)含有B2)所述表达盒的转基因动物细胞系；B11)含有B3)所述重组载体的转基因动物细胞系；B12)含有B4)所述重组载体的转基因动物细胞系；B13)含有B1)所述DNA分子的转基因植物细胞系。3.登革病毒抑制剂，其特征在于：所述登革病毒抑制剂含有权利要求1所述的单链RNA分子、其修饰物、或其药学上可接受的盐。4.预防或/和治疗登革病毒感染的药物，其特征在于：所述药物含有权利要求1所述的单链RNA分子、其修饰物、或其药学上可接受的盐。5.根据权利要求3所述...

【专利技术属性】
技术研发人员：孙岩松，李浩，韩尧，依文彦博，
申请(专利权)人：中国人民解放军军事科学院军事医学研究院，
类型：发明
国别省市：