以pGEX6P1作为载体制备肿瘤相关抗原NY-ESO-1的方法及应用技术

本发明专利技术涉及生物医药技术领域，提供了以pGEX6P1作为载体制备肿瘤相关抗原NY

【技术实现步骤摘要】
以pGEX6P1作为载体制备肿瘤相关抗原NY
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ESO
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1的方法及应用


[0001]本专利技术属于生物医药领域，具体涉及肿瘤相关抗原NY
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ESO
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1的制备方法及其相关应用。

技术介绍

[0002]肿瘤相关抗原(tumor associated antigen,TAA)是指在肿瘤细胞或正常细胞上都存在的一类抗原分子，常用于临床肿瘤的诊断。它并非肿瘤细胞所特有，正常细胞可微量合成，并且在肿瘤细胞增殖时高度表达。在实体瘤治疗中，TAA靶点是特异性抗肿瘤免疫治疗的首选，针对TAA的抗体不仅可以通过ADCC效应直接杀死肿瘤细胞，也可以作为诊断标记物或者创新性的增加传统癌症疗法的靶向性。以TAA为基础的肿瘤治疗性疫苗可以激活机体的免疫系统，诱导产生特异性的免疫细胞，对肿瘤细胞产生杀伤，还可以TAA为靶点，设计相关的TCR/CAR，制备出TAA特异性的T细胞，用以开展细胞治疗。
[0003]NY
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ESO
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1(New York Esophageal Squamous Cell Carcinoma)抗原首先是由Chen YT等
[1]通过SEREX技术从食管癌组织中筛选得到。此后，大量文献相继报道，在滑膜肉瘤(80％)、恶性黑素瘤(45％)、卵巢癌(43％)等肿瘤组织中表达较高，在肝癌(43％)、尿路上皮癌(35％)、多发性骨髓瘤(26％)、肺癌(18.2％)中也有不同程度的表达
[2
‑
5]，为将来免疫治疗的应用提供了基础。NY
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ESO
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1在正常组织中也有表达，但是由于血睾屏障的存在，使得这些正常组织并不会遭受免疫毒性，说明NY
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ESO
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1具有肿瘤特异性，展现了良好的临床应用前景。研究发现，在NY
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ESO
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1mRNA阳性的恶性黑素瘤患者中，50％患者血清中存在自发性特异性抗体
[6]；对1374名乳腺癌患者进行血液检测后发现，1％的患者体内可以检测到自发性的NY
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ESO
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1特异性抗体
[7]；此外，在肺癌、多发性骨髓瘤等患者中也有类似发现
[8，9]，说明NY
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1具有较强的激发特异性体液免疫应答的能力。不仅如此，NY
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1还能诱导自发性特异性细胞免疫反应，主要是激活CD4+和CD8+T淋巴细胞。Jager团队
[10]首先发现NY
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1能诱导特异性的细胞免疫应答，随后Chen、Zeng等
[11,12]也相继发现NY
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1抗原肽能被CD4+或CD8+T淋巴细胞所识别，并与HLA
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I类或HLA
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II类分子结合，产生特异性的细胞免疫应答，而且90％以上血清NY
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1抗体(+)的患者体内存在特异性CTL。因此，NY
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1被认为是理想的肿瘤免疫治疗靶标。
[0004]现有NY
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1抗原的制备主要通过包涵体的方法，不仅需要复性等复杂的操作，而且也会影响得率，仅能得到微克级别的蛋白。与此同时，商品化的NY
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1蛋白价格极其昂贵，如某品牌通过大肠杆菌重组表达的NY
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ESO
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1蛋白价格为：￥3220/2μg、
[0005]￥4945/5μg、￥8970/10μg。因此亟需对现有制备方法进行优化，以期优化NY
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ESO
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1蛋白的价格。

技术实现思路

[0006]本专利技术基于上述研究进行，对现有NY
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ESO
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1蛋白的制备进行改进，使得蛋白主要
在上清中，避免包涵体复性步骤，制备流程更加简便，同时一次得率可达mg级别，得率更高。
[0007]本专利技术的第一方面，提供了一种肿瘤相关抗原NY
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ESO
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1的制备方法，主体包括如下步骤：将NY
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ESO
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1基因与带GST标签蛋白的pGEX6P1载体重组后转染感受态细胞，依次经种子获取及扩大培养、IPTG诱导后破菌收集上清、纯化后得到毫克级别的GST/NY
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ESO
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1融合蛋白。
[0008]其中，NY
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ESO
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1的基因序列如SEQ ID NO.1所示，GST标签蛋白的基因序列如SEQ ID NO.2所示，GST/NY
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ESO
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1融合蛋白的大小为40kD，基因序列和氨基酸序列分别如SEQ ID NO.5和SEQ ID NO.6所示。
[0009]进一步，本专利技术肿瘤相关抗原NY
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ESO
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1的制备方法具体包括如下步骤：
[0010]A、pGEX6P1/NY
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ESO
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1重组载体构建
[0011]采用EcoR I和Xho I双酶切位点，将pGEX6P1载体进行切开，与NY
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ESO
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1基因序列进行拼接，所得的pGEX6P1/NY
‑
ESO
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1重组载体经测序验证后，用于后续扩增、表达；
[0012]其中，NY
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1的BamHI酶切位点引物序列如SEQ ID NO.3所示，XhoI酶切位点的引物序列如SEQ ID NO.4所示。
[0013]B、转染
[0014]将pGEX6P1/NY
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ESO
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1重组载体转入BL
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21/DE3感受态细胞，扩增后涂到氨苄抗性的LB培养板上(氨苄浓度20μg/mL)，挑菌；
[0015]C、种子获取及扩大培养
[0016]用枪头挑出菌落，放入氨苄抗性的LB培养基内，37℃，200rpm进行扩增；而后取菌液加入到250倍体积的氨苄抗性LB培养基中37℃，200rpm继续扩增，作为接种的种子；取多份种子液分别加入至多瓶200倍体积的氨苄抗性LB培养基中37℃，200rpm摇床扩大培养，过程中监测OD值，当OD值为0.6
‑
0.7时，停止摇菌；
[0017]D、IPTG诱导后破菌收集上清
[0018]向步骤C的每瓶培养瓶中加入终浓度为0.5mM的IPTG，20℃、180r本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种肿瘤相关抗原NY
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ESO
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1的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：将NY
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ESO
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1基因与带GST标签蛋白的pGEX6P1载体重组后转染感受态细胞，依次经种子获取及扩大培养、IPTG诱导后破菌收集上清、纯化后得到毫克级别的GST/NY
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ESO
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1融合蛋白，而后去除GST标签。2.根据权利要求1所述的肿瘤相关抗原NY
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ESO
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1的制备方法，其特征在于：其中，NY
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ESO
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1的基因序列如SEQ ID NO.1所示，GST标签蛋白的基因序列如SEQ ID NO.2所示。3.根据权利要求1所述的肿瘤相关抗原NY
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ESO
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1的制备方法，其特征在于：其中，GST/NY
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ESO
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1融合蛋白的大小为40kD，基因序列和氨基酸序列分别如SEQ ID NO.5和SEQ ID NO.6所示。4.根据权利要求1所述的肿瘤相关抗原NY
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1的制备方法，其特征在于：其中，所述肿瘤相关抗原NY
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1的制备方法具体包括如下步骤：A、pGEX6P1/NY
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ESO
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1重组载体构建采用EcoR I和Xho I双酶切位点，将pGEX6P1载体进行切开，与NY
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ESO
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1基因序列进行拼接，所得的pGEX6P1/NY
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ESO
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1重组载体经测序验证后，用于后续扩增、表达；B、转染将pGEX6P1/NY
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ESO
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1重组载体转入BL
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21/DE3感受态细胞，扩增后涂到氨苄抗性的LB培养板上，挑菌；C、种子获取及扩大培养用枪头挑出菌落，放入氨苄抗性的LB培养基内，37℃，200rpm进行扩增；而后取菌液加入到250倍体积的氨苄抗性LB培养基中继续扩增，作为接种的种子；取多份种子液分别加入至多瓶200倍体积的氨苄抗性LB培养基中摇床扩大培养，当OD值为0.6
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0.7时，停止摇菌；D、IPTG诱导后破菌收集上清向步骤C的每瓶培养瓶中加入终浓度为0.5mM的IPTG，20℃、180rpm诱导过夜；而后将所有菌液转到离心瓶中，配平，5000rpm，15min离心后弃上清；向菌体中加入破菌缓冲液并充分打散，采用超声264W/m2、0.5Hz破菌后收集可溶上清；E、纯化采用GSTRap柱子纯化，平衡液平衡后用洗脱液洗脱，待出现UV＝280nm的峰开始出现上升趋势后立即收集洗脱液，峰最高值约为600，待峰落下平稳后停止收集，采用平衡液继续平衡并收集流穿液；将洗脱液透析后采用Sepharose Q柱纯化，收集流穿液和洗脱液，将Sepharose Q柱纯化后收集的流穿液和洗脱液再次重复上述纯化步骤，收集洗脱液和流穿液，获得毫克级别的...

【专利技术属性】
技术研发人员：虞淦军，吴艳峰，丁凯，何晓波，张亚楠，
申请(专利权)人：上海长征医院，
类型：发明
国别省市：