一种从人细胞无血清培养上清中纯化重组人血白蛋白的方法技术

本发明专利技术提供一种从人细胞无血清培养上清中纯化重组人血白蛋白的方法，包括如下步骤：A）用辛酸钠稳定人细胞无血清培养上清中的重组人血白蛋白；B）9%乙醇沉淀杂蛋白；C）68℃水浴处理无血清培养液30分钟；D)pH5.85、25%乙醇、

【技术实现步骤摘要】
一种从人细胞无血清培养上清中纯化重组人血白蛋白的方法


[0001]本专利技术涉及生物技术与蛋白质纯化领域，尤其涉及一种从表达重组人血白蛋白的人工程细胞株的无血清培养液中纯化重组人血白蛋白的方法。

技术介绍

[0002]人血白蛋白（Human Serum Albumin, HSA）是由肝脏细胞产生并分泌到血液中的重要分子，是血浆中最为丰富的蛋白质，在正常人血中的含量约为42克/升，占血浆总蛋白的60％[1]。人血白蛋白的结构非常稳定，在体内的半衰期长达19天。人血白蛋白具有多种生理功能，对人体非常重要，其功能包括：维持血浆的胶体渗透压，结合与运输重要的生物学功能分子，维持毛细血管膜的通透性，保护神经细胞，稳定细胞外体液，促进伤口愈合和抗氧化[2]。具体在运输生物学功能分子方面，人血白蛋白能够可逆地结合多种内源性和外源性物质，因而能够在循环系统中作为一个通用载体，运输蛋白质或其它营养物质。目前，已知人血白蛋白作为载体物质，负责血液中氨基酸、激素、脂肪酸、无机盐离子与其它生物学活性分子及某些药物等的运输。
[0003]人血白蛋白作为药物在临床上具有十分重要的价值。人血白蛋白已经被广泛用于医学和医药工业，包括：作为注射用药用于治疗各种创伤、烧伤、外科手术过程中或手术后失血、水肿、危重病人补液、多种低白蛋白血症以及许多慢性消耗性疾病，如肿瘤等；在药物配方中作为活性药物的稳定剂、药物载体、疫苗辅药、赋形剂或安慰剂；在医药工业中作为细胞培养基添加物等。人血白蛋白作为融合肽与某些蛋白药物融合，能够起到延长药物在体内的保留时间，从而使药物长效化[1,2]。由于其重要而广泛的功能，人血白蛋白是大宗临床一线用药，对临床医学应用具有重大的战略意义。
[0004]天然人血白蛋白的获取目前是从血浆中提取[3]。Cohn和其同事在上世纪中期首次专利技术了通过冷乙醇沉淀的方法从血浆中分离具有活性的人血白蛋白。该方法已经成为广泛使用的人血白蛋白提取方法，其原理是基于人血白蛋白和其它血浆蛋白在溶解度上的差异[4]。该方法可及性强、成本低、容易放大规模，而且由于乙醇具有杀灭病毒和细菌的作用，该方法可保障人血白蛋白免受病毒和细菌污染，因而在安全性方面也具有独特的优势[3]。为避免乙醇带来的蛋白质变性，目前已经发展了多种采用冷乙醇和层析方法相结合的提取方法，包括离子交换层析、亲和层析、流化床、分子筛等方法，使得人血白蛋白在纯度、活性等其它方面得到进一步提升[5
‑
7]。
[0005]由于天然人血白蛋白是从人血浆中提取而获得，难以满足巨大的市场需求。人血白蛋白在世界范围内都存在短缺现象，在中国有超过一半的注射用人血白蛋白依赖进口。利用重组技术生产重组人血白蛋白成为解决人血白蛋白短缺的最终途径[2]。若干个蛋白表达系统，包括大肠杆菌（Escherichia coli）、酿酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）、汉逊酵母（Hansenula polymorpha ）、毕赤酵母（Pichia pastoris）、转基因植物（土豆或水稻）都分别被开发成重组表达人血白蛋白的表达系统。
[0006]早在1981年美国的Genentech公司就在细菌大肠杆菌中首先表达了重组人白蛋白
[8]。由于大肠杆菌属于原核生物，其细胞中缺乏真核细胞的蛋白质折叠、加工和分泌系统，因此在大肠杆菌中表达重组人白蛋白不仅产量低，而且构象不正确，重组产物没有功能，该策略早已被弃用。
[0007]酵母表达系统中以毕赤酵母表现最为优异，因为该表达体系属于真核表达系统，因而在蛋白质折叠、翻译后修饰以及分泌能力方面具有一定优势。该系统的遗传操作简单、可高密度培养、培养基成本低廉、易于放大规模等特点也使得该体系为大多数研究者所青睐[9]。英国Delta生物技术公司、日本绿十字（Green Cross）和美国默克（Merck公司）相继投入了大量的人力物力，在酵母中成功表达了重组白蛋白，并达到了规模化生产的水平。在毕氏酵母中重组人血白蛋白最高产量已经达到10克/升甚至更高。但是在从酵母发酵液中提取重组白蛋白遇到了很大的挑战。从酵母发酵液中提取重组人血白蛋白的工艺较为复杂，是大规模产业化重组人血白蛋白的限速步骤[3]。由于人血白蛋白具有广泛的结合能力，酵母发酵体系中与白蛋白紧密结合的宿主杂质和色素等很难去除，导致下游纯化困难，纯化工艺十分复杂，因而成本高昂[10
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12]。通过培养基成分优化[10]、表达载体优化和下游纯化工艺的优化[2]，从酵母中大规模生产重组人血白蛋白已经成为现实，特别是纯化工艺的改进使得重组人血白蛋白的纯度大幅提高，从而使其免疫原性相对减弱，相关研发机构已经在酵母重人血白蛋白表达、纯化和临床试验中取得了重大的进展[2]。但从酵母中提取重组人血白蛋白目前都需要多步层析，包括离子交换层析、疏水层析、凝胶过滤层析，并结合发酵液稀释、升温孵育促使白蛋白与其结合的多糖杂质和色素解离等手段。也有通过部分去折叠并加以结晶以达到去除其结合的杂质的目的[10]。
[0008]以植物，如土豆或水稻，为生物反应器生产重组人血白蛋白是从成本和规模化的角度解决重组人血白蛋白短缺的另一个策略[13,14]，[15,16]。以水稻为反应器的研究在国外主要是日本和美国在开展，在国内有武汉禾元生物技术有限公司。武汉禾元生物技术有限公司通过基因工程实现了在水稻中规模化生产重组人血白蛋白，并通过多步纯化获得高纯度的重组人血白蛋白[15,17,18]，拿到了国家临床试验许可。从水稻中提取重组人血白蛋白需要经过粉碎、浸泡、离子交换、疏水层析、凝胶过滤等多步层析等纯化步骤才能最终获得高纯度的重组人血白蛋白[14,15,18]。
[0009]综上，无论是酵母表达体系还是植物表达体系，其重组人血白蛋白的纯化工艺都需要多步层析。层析介质属于昂贵的消耗性物料，增加了重组人血白蛋白的生产成本。另外，多步层析降低了得率并增加了时间成本[3,19]。
[0010]因此，有必要提供一种高效、低廉的人血白蛋白的表达与纯化工艺，以降低人血白蛋白的生产成本与时间成本。
[0011]我们在之前的工作中采用人肝细胞作为生物反应器表达重组人血白蛋白（中国专利ZL2021110440769.2），具体地利用人肝癌细胞HepG2/C3A作为生物反应器生产重组人血清白蛋白。该重组表达体系中的肝细胞可以在无血清培养基中进行悬浮扩大培养，肝细胞产生的重组人血白蛋白分泌到无血清培养基中。由于人血白蛋白在体内也是由肝细胞合成然后分泌到血液中的，因而我们的重组体系非常类似于人血白蛋白在体内的合成和分泌模式。
[0012]冷乙醇沉淀法是工业上从血浆中提取天然人血白蛋白通行的纯化方法[3]。虽然肝细胞表达体系所产生的含重组人血白蛋白的细胞培养液的组成和很多特性与血浆截然
不同，但是该重组表达体系与体内人血白蛋白产生具有一定的相似性，启发我们可以尝试采取从血浆中提取天然人血白蛋白的方式纯化该重组体系中的重组人血白蛋白。
[0013]由于人血白蛋白具有较高的稳定本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种从人细胞无血清培养上清中纯化重组人血白蛋白的方法，其特征在于，包括如下步骤：（1）用辛酸钠稳定人细胞无血清培养上清中的重组人血白蛋白；（2）乙醇沉淀杂蛋白；（3）无血清培养液的水浴加热处理；（4）乙醇进一步沉淀杂蛋白；（5）乙醇沉淀重组人血白蛋白。2.根据权利要求1所述的从人细胞无血清培养上清中纯化重组人血白蛋白的方法，其特征在于：在步骤（1）中，首先将无血清悬浮培养的细胞培养液在4℃、8000rpm离心30分钟，然后取上清加入辛酸钠，搅拌使其充分溶解。3.根据权利要求1所述的从人细胞无血清培养上清中纯化重组人血白蛋白的方法，其特征在于：在步骤（2）中，用2M的醋酸钠溶液调节细胞培养上清的pH值，然后在室温下边搅拌边滴加无水乙醇，持续搅拌1小时。4.根据权利要求1所述的从人细胞无血清培养上清中纯化重组人血白蛋白的方法，其特征在于：在步骤（3）中，（a）将含乙醇的无血清细胞培养液置于水浴中，在细胞培养液的温度达到指定数值后，维持该温度下继续温育30分钟，（b）将细胞培养液置于室温水浴中冷却，静置1小时，（c）取出细胞培养液4℃、8000rpm离心30分钟，去除沉淀，上清做下一步乙醇沉淀。5.根据权利要求1所述的从人细胞无血清培养上清中纯化重组人血白蛋白的方法，其特征在于：在步骤（4）中，（a）将步骤（3）中离心后的上清料液用量筒测量其体积为975mL，将料液装入烧杯中，边搅拌边加入浓度为2M的醋酸溶液调节其pH值，（b）冷却料液到
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8℃，（c）缓慢滴加
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20℃的无水乙醇，维持料液温度为
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8℃持续搅拌1小时，放
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20℃过夜，（d）4℃、8000rpm离心30分钟，去除沉淀，上清做下一步乙醇沉淀。6.根据权利要求1所述的从人细胞无血清培养上清中纯化重组人血白蛋白的方法，其特征在于：在步骤（5）中，（a）用量筒测量步骤（4）中离心后的料液体积，（b）测量料液的pH值，加入浓度为2M的醋酸溶液调节料液的pH值，（c）冷却料液到
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8℃，（d）缓慢滴加
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20℃的无水乙醇，维持料液温度为
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8℃，持续搅拌1小时，放
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20℃过夜，（e）4℃、8000rpm离心30分钟，保留沉淀，沉淀为纯的重组人血白蛋白，（f）用30mL无菌...

【专利技术属性】
技术研发人员：朱颂成，赵晓梅，
申请(专利权)人：上海安民生物技术有限公司，
类型：发明
国别省市：