文库制备方法和测序方法技术

本申请公开了文库制备方法和测序方法。本申请的第一方面提供一种文库制备方法，该文库制备方法包括以下步骤：提供双链核酸分子，打断，得到片段化产物；片段化产物经末端修复后加接头处理，得到接头产物；接头产物在外切酶作用下消化，得到消化产物；消化产物经滚环扩增，得到文库；接头包括依次的第一序列、第二序列和第三序列，第一序列和第三序列至少部分反向互补，使接头形成茎环结构。本方案中将双链核酸分子制备成环形DNA，并通过滚换扩增得到多拷贝文库，实现单一样本的多次测序，提高测序的准确度。采用这一文库制备方法，由于特定的接头结构的选择，可以将打断后的长度控制在较长水平，减少拼接成本，节省内存和计算时间。节省内存和计算时间。节省内存和计算时间。

【技术实现步骤摘要】
文库制备方法和测序方法


[0001]本申请涉及测序
，尤其是涉及文库制备方法和测序方法。

技术介绍

[0002]单分子测序技术主要包括单分子实时(Single molecule real
‑
time，SMRT)测序技术和单分子纳米孔(Nanopore)测序技术。其中，Nanopore测序技术的原理是纳米孔(微型小孔，本质上是在膜上形成通道)嵌入合成膜，并浸没在离子溶液中，使离子电流通过纳米孔。当DNA或RNA链通过纳米孔时，会对电流产生干扰，引起电流信号的改变，且不同的碱基会引起不同的电流信号变化。因此，与基于光信号的测序技术不同，Nanopore测序技术通过解码核酸通过纳米孔时的电流信号来确定碱基序列。
[0003]NGS测序技术中文库制备所需的建库时间长，而且文库长度短，但Nanopore测序技术则能够有效解决这一问题，其文库制备时间更短，且文库的读长相对较长。然而，现有Nanopore测序时主要采用单一拷贝的碱基序列进行测序，DNA链穿孔的速率过快，超过了现有光学和电子技术的检测分辨率，造成测序的准确率偏低。为此，部分研究尝试通过环化的方式构建多拷贝纳米孔文库来实现单一样本的多次测序，提高其准确率。但这类方法对于拷贝长度的要求较高，且环化效率不足。

技术实现思路

[0004]本申请旨在至少解决现有技术中存在的技术问题之一。为此，本申请提出一种文库制备方法和测序方法。
[0005]本申请的第一方面，提供文库制备方法，该文库制备方法包括以下步骤：
[0006]S100：提供双链核酸分子，打断，得到片段化产物；
[0007]S200：所述片段化产物经末端修复后加接头处理，得到接头产物；
[0008]S300：所述接头产物在外切酶作用下消化，得到消化产物；
[0009]S400：所述消化产物经滚环扩增，得到文库；
[0010]其中，所述接头包括依次的第一序列、第二序列和第三序列，所述第一序列和所述第三序列至少部分反向互补，使所述接头形成茎环结构。
[0011]在本申请的一些实施方式中，双链核酸分子为双链DNA分子。
[0012]在本申请的一些实施方式中，接头序列包括自5
′
端依次的第一序列、第二序列和第三序列，第一序列和第三序列反向互补形成茎环结构的茎，并在接头的3
′
端产生突出的碱基T，而第二序列成环。这样，末端修复时，双链DNA的3
′
端加上A尾后，可以与接头形成A
‑
T连接，从而使接头的两端分别与双链核酸分子的两条链连接，环化形成由两条互补链形成的单链核酸分子。
[0013]在本申请的一些实施方式中，第三序列包含1～20个与第一序列反向互补的碱基。在其中一些实施方式中，第三序列包含1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20个与第一序列反向互补的碱基。在其中一些实施方式中，第三序列包含5～15、6～
14、7～13、8～12、9～11个与第一序列反向互补的碱基。
[0014]在本申请的一些实施方式中，第三序列包含1～20个与第一序列互补的碱基以及3
′
端1～10个突出的碱基T。在其中一些实施方式中，第三序列包含1～20个与第一序列互补的碱基以及3
′
端10、9、8、7、6、5、4、3、2、1个突出的碱基T。在其中一些实施方式中，第三序列包含1～20个与第一序列互补的碱基以及3
′
端1～8、1～6、1～4、1～3、1～2个突出的碱基T。
[0015]在本申请的一些实施方式中，第二序列包括0～30个碱基。在其中一些实施方式中，第二序列包括1～30、2～30、5～30、8～30、10～30、20～30个碱基。可以理解的是，第二序列中不包括可以互补配对的碱基。
[0016]在本申请的一些实施方式中，接头的第一序列包括ATCTCTCTC，第三序列包括GAGAGAGATT。
[0017]在本申请的一些实施方式中，接头的第二序列包括TTTTCCTCCTCCTCCGTTGTTGTTGTT。
[0018]在本申请的一些实施方式中，接头的序列如下所示：
[0019]ATCTCTCTCTTTTCCTCCTCCTCCGTTGTTGTTGTTGAGAGAGATT(SEQ ID No.1)。
[0020]在本申请的一些实施方式中，S100中，利用g
‑
tube将双链核酸分子打断。其中，g
‑
tube打断双链核酸分子是指提供具有孔口的g
‑
tube和离心机，通过离心力推动双链核酸分子通过孔口，对通过中的双链核酸分子产生剪切力，而使双链核酸分子发生片段化而被打断。在其中一些具体的实施方式中，调整离心机转速、离心时间以及通过孔口的流量等因素，改变片段化产物的长度。
[0021]在本申请的一些实施方式中，片段化产物的长度为1～50kbp，例如可以是1kbp、2kbp、3kbp、5kbp、10kbp、15kbp、20kbp、25kbp、30kbp、35kbp、40kbp、45kbp、50kbp。在其中一些实施方式中，片段化产物的长度为5～40kbp，10～30kbp。
[0022]在本申请的一些实施方式中，利用g
‑
tube将双链核酸分子打断的离心转速为3000～15000rpm，例如可以是3000rpm、5000rpm、8000rpm、10000rpm、12000rpm、15000rpm。在其中一些实施方式中，利用g
‑
tube将双链核酸分子打断的离心转速为3000～10000rpm，3000～8000rpm。
[0023]在本申请的一些实施方式中，利用g
‑
tube将双链核酸分子打断的离心时间为10s～10min，例如可以是10s、20s、30s、40s、50s、60s、2min、3min、5min、8min、10min。在其中一些实施方式中，利用g
‑
tube将双链核酸分子打断的离心时间为30s～8min，1～5min。
[0024]在本申请的一些实施方式中，利用g
‑
tube将双链核酸分子打断的离心转速为3000～15000rpm，离心时间为10s～10min。
[0025]在本申请的一些实施方式中，S100中，片段化产物经纯化处理，具体的纯化方法可以包括磁珠处理、过柱处理等其中至少一种。
[0026]在本申请的一些实施方式中，纯化处理为磁珠纯化。
[0027]在本申请的一些实施方式中，磁珠纯化处理的步骤包括将片段化产物与磁珠混合孵育，随后磁吸弃上清，洗涤后洗脱得到纯化产物。
[0028]在本申请的一些实施方式中，磁珠纯化处理中采用乙醇洗涤。
[0029]在本申请的一些实施方式中，洗涤用乙醇为60％以上本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.文库制备方法，其特征在于，包括以下步骤：S100：提供双链核酸分子，打断，得到片段化产物；S200：所述片段化产物经末端修复后加接头处理，得到接头产物；S300：所述接头产物在外切酶作用下消化，得到消化产物；S400：所述消化产物经滚环扩增，得到文库；其中，所述接头包括依次的第一序列、第二序列和第三序列，所述第一序列和所述第三序列至少部分反向互补，使所述接头形成茎环结构。2.根据权利要求1所述的文库制备方法，其特征在于，所述接头的序列如SEQ ID No.1所示。3.根据权利要求1所述的文库制备方法，其特征在于，所述外切酶包括ExoⅠ和ExoⅢ。4.根据权利要求1所述的文库制备方法，其特征在于，所述片段化...

【专利技术属性】
技术研发人员：弗拉基米尔，
申请(专利权)人：安序源生物科技深圳有限公司，
类型：发明
国别省市：