一种乳酸克鲁维酵母裂解工程菌及其应用制造技术

本发明专利技术公开了一种乳酸克鲁维酵母裂解工程菌及其应用，属于生物工程技术。本发明专利技术提供了甘露糖蛋白在促进乳酸克鲁维酵母菌胞内物质释放方面的新用途，通过敲除甘露糖蛋白编码基因，提高乳酸克鲁维酵母对裂解酶Lyticase的敏感性，可使构建的乳酸克鲁维酵母工程菌裂解时间较短，30min内几乎可使细胞完全裂解。本发明专利技术的乳酸克鲁维酵母裂解方法操作简便，在酶活检测、蛋白鉴定等方面有广阔的应用前景。蛋白鉴定等方面有广阔的应用前景。蛋白鉴定等方面有广阔的应用前景。

【技术实现步骤摘要】
一种乳酸克鲁维酵母裂解工程菌及其应用


[0001]本专利技术涉及一种乳酸克鲁维酵母裂解工程菌及其应用，属于生物工程


技术介绍

[0002]乳酸克鲁维酵母(Kluyveromyces lactis)是一种能够以乳糖为唯一碳源生长的酵母，大多数乳酸克鲁维酵母都分离自以乳糖为碳源的牛奶制品中，是一个食品安全级别较高的菌株，在食品酶和药用蛋白表达上应用广泛。
[0003]作为新兴非常规酵母，乳酸克鲁维酵母工业化规模的产酶能力使其在生物
具有重要应用。乳糖酶是乳酸克鲁维酵母生产的一种重要的内源糖苷水解酶，主要应用于乳制品工业生产低乳糖乳制品，具有巨大的市场潜力和发展前景。野生型乳酸克鲁维酵母所产乳糖酶多为胞内酶，一般要进行破壁释放胞内物质。
[0004]目前实验室中乳酸克鲁维酵母的破壁方法很多，包括机械破壁法(高压匀浆法、珠磨法)、基于能量波的破壁法(微波破壁法、超声破壁法)、化学法破壁法(渗透压冲击法、酶法、酸处理、表面活性剂处理)以及生物法破壁等。虽然这些方法经过不断改进，用于实验室中不同胞内产物的提取，但仍存在一些缺点：对仪器要求高、成本高、操作繁琐、破壁时间较长等。复杂的下游工艺大大提高了乳糖酶的工业成本，影响其更大规模的应用。

技术实现思路

[0005]针对目前破壁技术复杂、工业应用成本较高的缺点，本专利技术旨在提供一种乳酸克鲁维酵母裂解工程菌，并将其应用于乳酸克鲁维酵母快速裂解后的胞内活性物质检测。
[0006]本专利技术提供甘露糖蛋白编码基因在促进乳酸克鲁维酵母菌胞内物质释放方面的应用。
[0007]在一种实施方式中，所述甘露糖蛋白编码基因为KLLA0_E01057g，具有如SEQ ID NO.1所示的核苷酸序列。
[0008]在一种实施方式中，所述应用是降低所述甘露糖蛋白编码基因在乳酸克鲁维酵母菌中的表达量。
[0009]在一种实施方式中，所述应用是敲除或沉默所述甘露糖蛋白编码基因。
[0010]本专利技术还提供一种乳酸克鲁维酵母工程菌，所述乳酸克鲁维酵母工程菌的甘露糖蛋白编码基因缺失或沉默。
[0011]在一种实施方式中，所述乳酸克鲁维酵母工程菌以乳酸克鲁维酵母JNXR
‑
2101为出发菌株，所述乳酸克鲁维酵母JNXR
‑
2101公开于公开号为CN114806906A的专利申请文件中。
[0012]本专利技术还提供了含有所述乳酸克鲁维酵母工程菌和裂解酶的试剂盒。
[0013]本专利技术还提供了所述乳酸克鲁维酵母裂解工程菌快速裂解释放胞内物质的方法，包括如下步骤：
[0014]培养重组菌株，加入一定浓度裂解酶Lyticase孵育一段时间，使乳酸克鲁维酵母
胞内物质释放到胞外。
[0015]在一种实施方式中，所述裂解酶Lyticase浓度为1～20U/mL，孵育时间为1～60min。
[0016]在一种实施方式中，所述裂解酶Lyticase的反应浓度为5～20U/mL。
[0017]本专利技术还提供所述乳酸克鲁维酵母工程菌，或所述试剂盒，或所述方法在酶活检测、蛋白鉴定等方面的应用。
[0018]有益效果：
[0019](1)本专利技术的操作对象为乳酸克鲁维酵母，一种食品安全级别较高的工业菌株，具有广泛的应用前景；
[0020](2)本专利技术提供了甘露糖蛋白基因的新用途，该基因的敲除对于突变菌株的生长几乎无影响；
[0021](3)本专利技术构建的敲除了甘露糖蛋白基因的乳酸克鲁维酵母裂解时间较短，30min内几乎可使细胞完全裂解，大幅缩短以往乳酸克鲁维酵母裂解的时间；
[0022](4)本专利技术的乳酸克鲁维酵母裂解方法操作简便，处理过程中无需添加额外试剂和玻璃珠，简化实验流程；应用广泛，裂解后的乳酸克鲁维酵母细胞可进行酶活检测、蛋白鉴定。
附图说明
[0023]图1为重组载体pUDP025
‑
Cas9
‑
gE01057g质粒图谱；
[0024]图2为乳酸克鲁维酵母裂解工程菌JNXR
‑
2101ΔE01057g与野生型JNXR
‑
2101生长产酶状况；
[0025]图3为乳酸克鲁维酵母突变株对于裂解酶Lyticase的敏感度及酶活检测结果；
[0026]图4为Lyticase裂解法和Fastprep机械破壁法应用于乳酸克鲁维酵母JNXR
‑
2101ΔE01057g酶活测定；
[0027]图5为裂解体系应用于乳酸克鲁维酵母JNXR
‑
2101ΔE01057g蛋白鉴定结果；
[0028]图6为乳酸克鲁维酵母突变株JNXR
‑
2101ΔE01057g与野生型JNXR
‑
2101的冷场发射扫描电子显微镜图；
[0029]图7为乳酸克鲁维酵母突变株JNXR
‑
2101ΔE01057g的5L罐发酵结果；
具体实施方式
[0030]培养基：
[0031]YPD固体培养基：胰蛋白胨20g/L、酵母粉10g/L、葡萄糖20g/L、琼脂20g/L。
[0032]YPL培养基：胰蛋白胨20g/L、酵母粉10g/L、乳糖20g/L。
[0033]5L罐发酵培养基成分：乳糖浓度40g/L，玉米浆40g/L、氮源50g/L、硫酸锰0.3g/L、硫酸镁0.5g/L。
[0034]本专利技术通过构建pUDP025
‑
Cas9
‑
gE01057g载体及供体DNA，将其转化至乳酸克鲁维酵母JNXR
‑
2101感受态细胞以敲除甘露糖蛋白基因KLLA0_E01057g，构建一种乳酸克鲁维酵母快速裂解工程菌JNXR
‑
2101ΔE01057g。通过裂解酶Lyticase处理乳酸克鲁维酵母裂解工程菌，获取胞内活性物质进行胞内蛋白快速检测及鉴定，并对其进行5L发酵罐培养。下面对
本专利技术作进一步的详细描述：
[0035]乳糖酶活性检测：
[0036]取0.3mL待测酶液，加入1.5mL ONPG(2.5g/L)溶液，30℃水浴10min后加入0.6mL Na2CO3(50g/L)溶液，在420nm处测定吸光度值。粗酶液需稀释一定梯度使吸光值在标曲范围(0～0.5U/mL)内。
[0037]乳糖酶酶活(U/mL)＝((ΔA
420
‑
C0)
×
V
×
n)/(K
×
T
×
v)；
[0038]其中，ΔA
420
为反应后测定吸光度值；C0为标准曲线截距；V为反应总体积；n为酶液稀释倍数；K为标准曲线斜率；T为反应时间；v为酶液体积。
[0039]裂解率的计算：按如下公式计算裂解率：
[0040]细胞裂解率(％)＝(本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.甘露糖蛋白编码基因在促进乳酸克鲁维酵母菌胞内物质释放方面的应用，其特征在于，所述甘露糖蛋白具有SEQ ID NO.2所示的氨基酸序列。2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述应用是敲除或沉默所述甘露糖蛋白编码基因。3.根据权利要求2所述的应用，其特征在于，所述甘露糖蛋白编码基因具有如SEQ IDNO.1所示的核苷酸序列。4.一种乳酸克鲁维酵母工程菌，其特征在于，所述乳酸克鲁维酵母工程菌的甘露糖蛋白编码基因缺失或沉默；所述甘露糖蛋白编码基因具有如SEQ ID NO.1所示的核苷酸序列。5.根据权利要求4所述的乳酸克鲁维酵母工程菌，其特征在于，以乳酸克鲁维酵母JNXR
‑
2101为出...

【专利技术属性】
技术研发人员：张国强，李江华，沈秀茹，陈坚，堵国成，廖灵通，
申请(专利权)人：江南大学，
类型：发明
国别省市：