靶向肝细胞癌的CAR-巨噬细胞的制备方法及其应用技术

本发明专利技术属于生物医药技术领域，具体涉及一种靶向肝细胞癌的CAR

【技术实现步骤摘要】
靶向肝细胞癌的CAR
‑
巨噬细胞的制备方法及其应用


[0001]本专利技术属于生物医药
，具体涉及一种靶向肝细胞癌的CAR
‑
巨噬细胞的制备方法及其应用。

技术介绍

[0002]公开该
技术介绍
部分的信息仅仅旨在增加对本专利技术的总体背景的理解，而不必然被视为承认或以任何形式暗示该信息构成已经成为本领域一般技术人员所公知的现有技术。
[0003]嵌合抗原受体修饰的T细胞(CAR
‑
T)疗法是在体外利用基因工程的方法修饰患者外周血T细胞，赋予T细胞靶向识别肿瘤细胞表面抗原的特性，经体外扩增培养后回输到患者体内进行治疗肿瘤的方法。自2017年FDA批准诺华与吉利德的CAR
‑
T细胞疗法产品上市起，CAR
‑
T疗法已成为免疫治疗领域的研究热点之一，并广泛应用于恶性血液肿瘤的临床治疗。但在实体肿瘤治疗中，CAR
‑
T细胞因难以穿透肿瘤而无法发挥作用，同时CAR
‑
T细胞在杀伤肿瘤细胞时分泌具有胞毒作用的颗粒酶、穿孔素等会造成细胞因子释放综合征，严重时会危及生命。
[0004]巨噬细胞在机体固有免疫与适应性免疫中发挥关键作用，并具有良好的穿透性，可有效渗透到肿瘤内部，在肿瘤部位浸润丰富。此外，与T细胞“分泌”为主的胞毒作用不同，巨噬细胞主要通过吞噬和抗原递呈作用发挥抗肿瘤免疫作用。若能赋予巨噬细胞特异性识别肿瘤细胞的能力，同时充分调动其吞噬及抗原递呈功能，巨噬细胞将在实体瘤中发挥强大的抗肿瘤免疫作用。因此，嵌合抗原受体修饰的巨噬细胞(CAR
‑
M)疗法有望成为治疗实体瘤的新型免疫治疗工具。
[0005]肝细胞癌(hepatocellular carcinoma,HCC)，约占原发性肝癌的75％～85％。GPC3在肝细胞癌细胞表面的特异性高表达，使其成为良好的免疫治疗靶点。因此，构建靶向GPC3的CAR
‑
M可以实现对肝细胞癌的精准识别，进而发挥吞噬、抗原递呈作用，激活抗肿瘤免疫应答。
[0006]mRNA编码蛋白质的氨基酸序列，在胞质中与核糖体结合完成蛋白质翻译。与质粒相比，mRNA不需要进入细胞核，降低了递送难度；同时不存在插入基因组引起的基因突变风险，这凸显了mRNA的递送优势。但mRNA链是带负电的单链核酸，本身不稳定且易被多种核酸酶降解，与细胞膜之间的静电排斥也使其难以进入细胞发挥作用。因此，需要合理构建mRNA的结构以提高其稳定性，同时开发mRNA的递送系统，以满足CAR
‑
M的高效转染。

技术实现思路

[0007]为了解决现有技术的不足，本专利技术的目的是提供一种靶向肝细胞癌的CAR
‑
巨噬细胞的制备方法及其应用，能够特异性识别肝细胞癌，增强对肝细胞癌免疫治疗的效果。
[0008]为了实现上述目的，本专利技术是通过如下的技术方案来实现：
[0009]第一方面，本专利技术提供了一种嵌合抗原受体，所述嵌合抗原受体包括胞外结构域、
跨膜区、胞内信号传导结构域；
[0010]所述胞外结构域包括前导信号肽段、抗原识别结构域、myc标签基因以及铰链区；所述抗原识别结构域衍生自肝细胞癌细胞特异性标志物GPC3的单克隆抗体G15，所述G15的编码氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示。
[0011]第二方面，本专利技术一种嵌合抗原受体的质粒表达载体，所述嵌合抗原受体如前所述，编码所述嵌合抗原受体的基因位于质粒表达载体上，核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示。
[0012]第三方面，本专利技术提供了一种编码嵌合抗原受体的mRNA，嵌合抗原受体如前所述，编码所述嵌合抗原受体的序列位于mRNA上，核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示；具体的，包含5
’
帽子、5
’
非编码区、嵌合抗原受体序列、3
’
非编码区以及3
’
polyA尾巴。
[0013]第四方面，本专利技术一种可电离脂质PSNO
‑
12，如下式所示，
[0014][0015]第五方面，本专利技术提供了一种含有嵌合抗原受体的质粒表达载体或编码嵌合抗原受体的mRNA的递送系统，所述递送系统为腺病毒、聚合物PBAE、金属框架ZIF
‑
8、阳离子白蛋白纳米粒、LNP中的一种或多种；
[0016]优选地，所述递送系统为LNP；
[0017]进一步优选地，所述LNP中递送材料为权利要求5所述的PSNO
‑
12、DOPE、胆固醇、DMG
‑
PEG2000的组合物。
[0018]第六方面，本专利技术提供了一种嵌合抗原受体修饰的免疫细胞，基于上述方面构建；
[0019]所述免疫细胞为T细胞、NK细胞、巨噬细胞中的一种，优选地，为巨噬细胞。
[0020]第七方面，本专利技术提供了第一方面所述嵌合抗原受体、第二方面所述嵌合抗原受体的质粒表达载体、第三方面所述编码嵌合抗原受体的mRNA、第四方面所述可电离脂质PSNO
‑
12、第五方面所述递送系统、第六方面所述免疫细胞在制备抗肿瘤药物中的应用；
[0021]优选地，所述抗肿瘤药物为抗肝细胞癌药物。
[0022]上述本专利技术的一种或多种技术方案取得的有益效果如下：
[0023](1)本专利技术提供了一种生成CAR
‑
M的CAR mRNA的递送系统，使用可电离脂质PSNO
‑
12、DOPE、胆固醇、DMG
‑
PEG2000通过微流控包载CAR mRNA，可以实现mRNA的有效递送。
[0024](2)本专利技术提供了一种递送mRNA的LNP的可电离脂质PSNO
‑
12及其合成路线。
[0025](3)本专利技术提供了一种体外及在体生成CAR
‑
M的方法，上述纳米药物递送载体有效实现了巨噬细胞体内外的CAR编辑，靶向吞噬肝细胞癌细胞，重塑肿瘤免疫微环境，特异性杀伤肝细胞癌，有效改善抗肿瘤效果。
附图说明
[0026]构成本专利技术的一部分的说明书附图用来提供对本专利技术的进一步理解，本专利技术的示意性实施例及其说明用于解释本专利技术，并不构成对本专利技术的不当限定。
[0027]图1是本申请实施例2的嵌合抗原受体的质粒表达载体的结构示意图；
[0028]图2是本申请实施例3的编码嵌合抗原受体的mRNA的结构示意图；
[0029]图3是本申请实施例4中可电离脂质PSNO
‑
12的合成路线；
[0030]图4是本申请实施例4中PSNO
‑
12核磁表征结果；
[0031]图5是本申请实施例5的LNP的制备示意图；
[0032]图6是本申请实施例5中LNP处方筛选结果；
[0033]图7是本申请实施例5的LNP的粒径表征；
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【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种嵌合抗原受体，其特征在于，所述嵌合抗原受体包括胞外结构域、跨膜区、胞内信号传导结构域；所述胞外结构域包括前导信号肽段、抗原识别结构域、myc标签基因以及铰链区；所述抗原识别结构域衍生自肝细胞癌细胞特异性标志物GPC3的单克隆抗体G15，所述G15的编码氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示。2.如权利要求1所述的嵌合抗原受体，其特征在于，所述前导信号肽段选自CD8αLeader；或，所述铰链区序列来源于IgG、CD8α或CD28中的一种或多种；进一步的，所述铰链区选自CD8α；或，所述跨膜区来源于CD4、CD8α，CD28或CD3ζ中的一种或多种；进一步的，所述跨膜结构选自CD8α；或，所述胞内结构域为信号转导域来源于FcεRIγ或CD3ζ中的一种或多种，进一步的，所述信号传导域为CD3ζ；进一步优选的，所述嵌合抗原受体的胞外向胞内段依次包括CD8前端信号肽、单克隆抗体G15可变片段、myc标签基因、CD8α铰链区、CD8α跨膜区、CD3ζ信号转导域，编码氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示。3.一种嵌合抗原受体的质粒表达载体，其特征在于，所述嵌合抗原受体如权利要求1所述，编码所述嵌合抗原受体的基因位于质粒表达载体上，核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示；优选地，所述质粒表达载体为PiggyBac转座子表达载体，含有CD68启动子、编码嵌合抗原受体的基因、3
’
ITR、5
’
ITR以及任选的可选择的标记；优选地；所述质粒表达载体的制备方法包括以下步骤：用肝细胞癌特异性标识物Glypican 3(GPC3)作为特异性抗原设计CAR细胞外结构域。以CD68启动子、anti
‑
GPC3
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scFv、myc标签基因、CD8跨膜区、CD3ζ胞内段、GFP等质粒片段，设计PCR引物并进行PCR扩增。采用内切酶NotⅠ或Bam HⅠ将载体质粒进行双酶切，并将双酶切产物按照1:1比例混合，在连接酶作用下连接形成CAR的表达质粒，用含有氨苄霉素的培养基筛选阳性克隆大肠杆菌，并将阳性克隆进行测序鉴定。4.一种编码嵌合抗原受体的mRNA，其特征在于，嵌合抗原受体如权利要求1所述，编码所述嵌合抗原受体的序列位于mRNA上，核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示；具体的，包含5
’
帽子、5
’
非编码区、嵌合抗原受体序列、3
’
非编码区以及3
’
polyA尾巴；优选地，所述编码嵌合抗原受体的mRNA的制备方法包括以下步骤：用肝细胞癌特异性标识物Glypican 3(GPC3)作为特异性抗原设计CAR细胞外结构域。CAR mRNA包含anti
‑
GPC3
‑
scFv、myc标签基因、CD8跨膜区、CD3ζ胞内段。设计线性化DNA模板，在T7聚合酶作用下完成转录，使用商业化试剂进行加帽，之后通过切向流过滤及层析进行纯化。5.一种可电离...

【专利技术属性】
技术研发人员：姜新义，杨贞梅，付志鹏，赵坤，
申请(专利权)人：南京凯玛生物科技有限公司，
类型：发明
国别省市：