分离新抗原-特异性T细胞受体序列的方法技术

公开了分离配对的T细胞受体(TCR)α和β链序列或其抗原结合部分的方法。还公开了自动鉴定TCR的TCRα和β链V区段序列和CDR3序列的方法，所述TCR对由癌症特异性突变编码的经突变的氨基酸序列具有抗原特异性。还公开了制备表达配对的TCRα和β链序列或其抗原结合部分的细胞群的方法。还公开了通过所述方法制备的经分离的TCRα和β链序列对和经分离的细胞群。群。

【技术实现步骤摘要】
分离新抗原
‑
特异性T细胞受体序列的方法
[0001]相关申请的交叉引用
[0002]本专利申请是申请号为201880022673.3的中国专利申请的分案申请，并且要求2017年3月31日提交的美国临时专利申请第62/479,398号的权益，其通过引用并入。
[0003]关于联邦资助的研究和开发的声明
[0004]本专利技术是在美国国立卫生研究院，美国国立癌症研究所授予的项目号ZIABC010985的政府支持下完成的。政府对本专利技术享有一定的权利。通过引用并入以电子方式提交的材料
[0005]通过引用整体并入本文的是计算机可读的核苷酸/氨基酸序列表，其与本文同时提交并标识如下：一个名为“737921SeqListing_ST25.txt”的5,530字节的ASCII(文本)文件，日期为2018年3月22日。
[0006]专利技术背景
[0007]使用已经遗传工程化以表达癌症抗原(如，新抗原(neoantigen))
‑
特异性T细胞受体(TCR)的细胞的过继性细胞疗法(ACT)可以在一些癌症患者中产生阳性临床响应。然而，成功使用TCR
‑
工程化的细胞来广泛治疗癌症和其他疾病的障碍仍然存在。例如，特异性识别癌症抗原(如，新抗原)的TCR可能难以鉴定和/或从患者分离。因此，需要改进的获得癌症
‑
反应性(如，新抗原
‑
反应性)TCR的方法。
[0008]专利技术简述
[0009]本专利技术的实施方案提供了分离配对的T细胞受体(TCR)α和β链序列或其抗原结合部分的方法，所述方法包括：(a)从生物样品分离对由癌症特异性突变编码的经突变的氨基酸序列具有抗原特异性的T细胞；(b)与呈递经突变的氨基酸序列的抗原呈递细胞(APC)一起共培养经分离的T细胞，使得所述T表达一种或多种T细胞活化标志物；(c)将共培养的T细胞分选成单独的单T细胞样品；(d)从每个单独的单T细胞样品分离mRNA；(e)对来自每个单独的单T细胞样品的mRNA进行测序，其中测序包括：(i)从所述mRNA产生cDNA并扩增所述cDNA；(ii)产生经扩增的cDNA的多个片段和标记所述多个片段；(iii)扩增所述cDNA的经标记的多个片段；和(iv)对所述cDNA的经扩增的经标记的多个片段进行测序；其中所述测序鉴定所述cDNA的多个片段中的每一个的序列；(f)将所述cDNA的多个片段中的每一个的序列与一种或多种T细胞活化标志物的已知序列比对，以鉴定哪个单T细胞样品含有表达一种或多种T细胞活化标志物的单个T细胞；(g)将所述cDNA的多个片段中的每一个的序列与参考TCR序列数据库比对，以鉴定在(f)中鉴定以表达一种或多种T细胞活化标志物的每个单独的单T细胞样品的cDNA的多个片段的TCRα链可变(V)区段序列和TCRβ链V区段序列；(h)在含有(g)中鉴定的所述TCRα链V区段序列的所述cDNA的多个片段中和在含有(g)中鉴定的所述TCRβ链V区段序列的所述cDNA的多个片段中鉴定TCR互补决定区3(CDR3)序列；(i)对共用相同α链CDR3氨基酸序列的cDNA的多个片段的数目和共用相同β链CDR3氨基酸序列的cDNA的多个片段的数目进行计数；(j)收集编码相同α链CDR3序列的cDNA的最高数目的多个片段、编码相同β链CDR3序列的cDNA的最高数目的多个片段和任选地，编码相同α链CDR3序列的cDNA的第二高数目的多个片段，其中由cDNA的第二高数目的多个片段编码的α链CDR3序
列不同于由cDNA的最高数目的多个片段编码的α链CDR3序列，以鉴定所述TCRα和β链CDR3序列；(k)鉴定(j)中收集的cDNA的最高数目的多个片段的TCRα链V区段序列、(j)中收集的cDNA的最高数目的多个片段的TCRβ链V区段序列和任选地，(j)中收集的cDNA的第二高数目的多个片段的TCRα链V区段序列，以鉴定所述TCRα和β链V区段序列；和(l)组装编码以下的一条或多条核苷酸序列：TCRα链，其包含(k)中鉴定的所述TCRα链V区段序列和(j)中收集的TCRα链CDR3序列，和TCRβ链，其包含(k)中鉴定的所述TCRβ链V区段序列和(j)中收集的TCRβ链CDR3序列，任选地组装编码以下的第二一条或多条核苷酸序列：第二TCRα链，其包含(k)中鉴定的cDNA的第二高数目的多个片段的TCRα链V区段序列和(j)中收集的cDNA的第二高数目的多个片段的TCRα链CDR3序列，和TCRβ链，其包含(k)中鉴定的TCRβ链V区段序列和(j)中收集的TCRβ链CDR3序列，以产生经分离的配对的TCRα和β链序列或其抗原结合部分。
[0010]本专利技术的另一个实施方案提供了自动鉴定T细胞受体(TCR)的TCRα和β链V区段序列和CDR3序列的方法，所述TCR对由癌症特异性突变编码的经突变的氨基酸序列具有抗原特异性，所述方法包括：(a)在用户计算设备处接收cDNA的多个片段的序列，其中在将单个T细胞与呈递所述经突变的氨基酸序列的抗原呈递细胞(APC)共培养，使得所述T细胞表达一种或多种T细胞活化标志物后，所述cDNA由这样的T细胞产生的mRNA编码；(b)对所述cDNA的多个片段中的每一个的序列与参考TCR序列数据库进行计算机化比对，以鉴定所述cDNA的多个片段的TCRα链可变(V)区段序列和TCRβ链V区段序列；(c)对含有(b)中鉴定的所述TCRα链V区段序列的cDNA的多个片段中和含有(b)中鉴定的所述TCRβ链V区段序列的cDNA的多个片段中的TCR互补决定区3(CDR3)序列进行计算机化鉴定；(d)对共用相同α链CDR3氨基酸序列的cDNA的多个片段的数目和共用相同β链CDR3氨基酸序列的cDNA的多个片段的数目进行计算机化计数；(e)对编码相同α链CDR3序列的cDNA的最高数目的多个片段、编码相同β链CDR3序列的cDNA的最高数目的多个片段和任选地，编码相同α链CDR3序列的cDNA的第二高数目的多个片段进行计算机化收集，其中由cDNA的第二高数目的多个片段编码的α链CDR3序列不同于由cDNA的最高数目的多个片段编码的α链CDR3序列，以鉴定所述TCRα和β链CDR3序列；和(f)对(e)中收集的cDNA的最高数目的多个片段的TCRα链V区段序列、(e)中收集的cDNA的最高数目的多个片段的TCRβ链V区段序列和任选地，(e)中收集的cDNA的第二高数目的多个片段的TCRα链V区段序列进行计算机化鉴定，以鉴定所述TCRα和β链V区段序列。
[0011]本专利技术的另一个实施方案提供了制备表达配对的TCRα和β链序列或其抗原结合部分的细胞群的方法，所述方法包括：根据本文所述的本专利技术方法中任一项分离配对的TCRα和β链序列或其抗原结合部分，和将编码经分离的配对的TCRα和β链序列或其抗原结合部分的核苷酸序列引入宿主细胞中以获得表达所述配对的TCRα和β链序列或其抗原结合部分的细胞。
[0012]本专利技术的另一个实施方案提供了根据本文所述的本专利技术方法中任一项分离的一对TCRα和本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.制备用于在哺乳动物中诱导针对癌症的免疫应答的药物的方法，所述方法包括：(a)从生物样品分离对由癌症特异性突变编码的经突变的氨基酸序列具有抗原特异性的T细胞；(b)与呈递经突变的氨基酸序列的抗原呈递细胞APC一起共培养经分离的T细胞，使得所述T细胞表达一种或多种T细胞活化标志物；(c)将共培养的T细胞分选成单独的单T细胞样品；(d)从每个单独的单T细胞样品分离mRNA；(e)对来自每个单独的单T细胞样品的mRNA进行测序，其中所述测序包括：(i)从所述mRNA产生cDNA并扩增所述cDNA；(ii)产生经扩增的cDNA的多个片段和标记所述多个片段；(iii)扩增所述cDNA的经标记的多个片段；和(iv)对所述cDNA的经扩增的标记的多个片段进行测序；其中所述测序鉴定所述cDNA的多个片段中的每一个的序列；(f)将所述cDNA的多个片段中的每一个的序列与一种或多种T细胞活化标志物的已知序列比对，以鉴定哪个单T细胞样品含有表达一种或多种T细胞活化标志物的单个T细胞；(g)将所述cDNA的多个片段中的每一个的序列与参考TCR序列数据库比对，以鉴定在(f)中鉴定的表达一种或多种T细胞活化标志物的每个单独的单T细胞样品的cDNA的多个片段的TCRα链可变V区段序列和TCRβ链V区段序列；(h)在含有(g)中鉴定的所述TCRα链V区段序列的所述cDNA的多个片段中和在含有(g)中鉴定的所述TCRβ链V区段序列的所述cDNA的多个片段中鉴定TCR互补决定区3CDR3序列；(i)对共用相同α链CDR3氨基酸序列的cDNA的多个片段的数目和共用相同β链CDR3氨基酸序列的cDNA的多个片段的数目进行计数；(j)收集编码相同α链CDR3序列的cDNA的最高数目的多个片段、编码相同β链CDR3序列的cDNA的最高数目的多个片段，以鉴定所述TCRα和β链CDR3序列；(k)鉴定(j)中收集的cDNA的最高数目的多个片段的TCRα链V区段序列，(j)中收集的cDNA的最高数目的多个片段的TCRβ链V区段序列，以鉴定所述TCRα和β链V区段序列；和(l)组装编码以下的一条或多条核苷酸序列：TCRα链，其包含(k)中鉴定的所述TCRα链V区段序列和(j)中收集的TCRα链CDR3序列，和TCRβ链，其包含(k)中鉴定的所述TCRβ链V区段序列和(j)中收集的TCRβ链CDR3序列，以产生经分离的配对的TCRα和β链序列或其抗原结合部分，(m)将编码经分离的配对的TCRα和β链序列或其抗原结合部分的核苷酸序列引入宿主细胞中，以获得表达所述配对的TCRα和β链序列或其抗原结合部分的细胞群；以及(n)将(m)中获得的所述细胞群配制成用于在哺乳动物中诱导针对癌症的免疫应答的药物。2.根据权利要求1所述的方法，其中(j)还包括收集编码相同α链CDR3序列的cDNA的第二高数目的多个片段，其中由cDNA的第二高数目的多个片段编码的α链CDR3序列不同于由cDNA的最高数目的多个片段编码的α链CDR3序列，(k)还包括鉴定(j)中收集的cDNA的第二
高数目的多个片段的TCRα链V区段序列，以及(l)还包括组装编码以下的第二一条或多条核苷酸序列：第二TCRα链，其包含(k)中鉴定的cDNA的第二高数目的多个片段的TCRα链V区段序列和(j)中收集的cDNA的第二高数目的多个片段的TCRα链CDR3序列，和所述TCRβ链，其包含(k)中鉴定的TCRβ链V区段序列和(j)中收集的TCRβ链CDR3序列。3.根据权利要求1或2所述的方法，其中所述一种或多种T细胞活化标志物包括以下中的一种或多种：干扰素IFN
‑
γ、白介素IL
‑
2、肿瘤坏死因子αTNF
‑
α、程序化细胞死亡1PD
‑
1、淋巴细胞活化基因3LAG
‑
3、T细胞免疫球蛋白和粘液素结构域3TIM
‑
3、4
‑
1BB、OX40、CD107a、颗粒酶B、粒细胞/单核细胞集落刺激因子GM
‑
CSF、IL
‑
4、IL
‑
5、IL
‑
9、IL
‑
10、IL
‑
...

【专利技术属性】
技术研发人员：卢勇成，彼得，
申请(专利权)人：美国卫生和人力服务部，
类型：发明
国别省市：