一种多重PCR体系的靶向检测半定量方法技术

本发明专利技术属于核酸分子生物学检测技术领域，尤其涉及一种多重PCR体系的靶向检测半定量方法。该半定量方法，先构建内参的校正系数，再获得内参和靶标之间的扩增差异系数；在多重PCR体系中加入内参和待测样本一起进行扩增，经两轮多重PCR扩增后获得测序文库；对所得文库进行高通量测序，获得原始测序数据：分析原始测序数据，计算病原靶标浓度，对病原体的真实载量进行评估。该半定量方法在NGS的PCR扩增中加入已知含量的内参序列，将该序列和从呼吸道样本中提取的核酸一起进行两轮PCR扩增完成文库构建、上机测序及生物信息学分析，评估待测呼吸道样本中病原微生物的真实含量。吸道样本中病原微生物的真实含量。吸道样本中病原微生物的真实含量。

【技术实现步骤摘要】
一种多重PCR体系的靶向检测半定量方法


[0001]本专利技术属于核酸分子生物学检测
，尤其涉及一种多重PCR体系的靶向检测半定量方法。

技术介绍

[0002]自2005年开发二代测序(NGS)技术以来，二代测序技术在临床病原微生物检测的应用越来越多。近十年以来，因二代测序技术的不断发展，国产测序仪的不断进步，大量基于二代测序的分子诊断产品不断涌现，并以其快速、全面、准确的特性为临床感染患者的病原学诊断提供了很大帮助。
[0003]随着临床需求的增加，基于二代测序的病原检测也由只能定性检测发展到了目前的定量检测。基于实时荧光定量聚合酶链式反应(Quantitative real
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time PCR，qPCR)技术进行病原的绝对定量是目前病原定量的经典做法，但由于其技术原理的限制以及高昂的价格，无法大规模用于病原定量产品中。16S和宏基因组测序研究中，菌群的数量和结构主要通过相对丰度来表示，但是由于16S和宏基因组测序很容易受宿主含量、病原体浓度、病原体基因组大小以及测序深度的影响，其检出序列数很难反映病原的真实含量，对于判断检出的可靠性以及监控病原载量较为困难，临床医生也无法掌握样本中的真实病原含量来调整治疗方案。
[0004]为了快速准确的对待测样本中特定病原微生物的含量进行定量，市面上已经开发了大量基于NGS方法用于病原微生物定量的技术。目前，有相关文献(Tettamanti Boshier F A,Srinivasan S,et al.Complementing 16S rRNA Gene Amplicon Sequencing with Total Bacterial Load To Infer Absolute Species Concentrations in the Vaginal Microbiome[J].mSystems，5(2),e00777
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19.)报道，通过16S扩增子测序可以获取物种相对丰度并结合细菌16S通用引物qPCR得到样本中总细菌载量，由此可以推断出样本中菌群物种的相对丰度，但是此方法操作复杂并且耗时较久，且不能对单个菌株进行绝对定量。此外，也有文献(Blauwkamp T A,Thair S,Rosen M J,et al.Analytical and clinical validation of amicrobial cell
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free DNA sequencing test for infectious disease[J].Nature microbiology,2019,4(4):663.)报道，在血浆宏基因组测序中添加简并碱基序列作为内参质控品，根据内参质控品的检测结果评估待测病原分子的含量，但其评估的病原含量与临床通用的浓度计算方式并非一致，且其中换算关系不明，无法在临床使用过程中提供指导。相比于qPCR技术，应用多重PCR扩增进行靶序列捕获具有操作简单、成本低，短时间大量富集目标DNA序列等显著优势，大大缩短了检测流程和检测时间。因此，开发一种基于多重PCR(聚合酶链式反应)捕获技术，并可快速、准确、一次性检测和定量样品中菌株拷贝数的方法，非常具有市场应用价值。

技术实现思路

[0005]为了克服上述现有技术的缺陷，本专利技术所要解决的技术问题是提供一种多重PCR
体系的靶向检测半定量方法，该方法能够快速、准确、全面的定量呼吸道样本中特定病原微生物的拷贝数。
[0006]为了解决上述技术问题，本专利技术采用的技术方案为一种多重PCR体系的靶向检测半定量方法，包括以下步骤：
[0007]S1：构建内参的校正系数；
[0008]S2：获得内参和靶标之间的扩增差异系数；
[0009]S3：在多重PCR体系中加入内参和待测样本一起进行扩增，经两轮多重PCR扩增后获得测序文库；
[0010]S4：对所得文库进行高通量测序，获得原始测序数据；
[0011]S5：分析原始测序数据，计算病原靶标浓度，对病原体的真实载量进行评估。
[0012]本专利技术的有益效果在于，本专利技术的多重PCR体系的靶向检测半定量方法，基于NGS测序原理结合多重PCR扩增技术，建立了呼吸道样本中病原微生物定量检测的方法。通过在NGS第一轮PCR扩增中加入已知含量的内参序列，将该序列和从呼吸道样本中提取的核酸一起进行两轮PCR扩增完成文库构建、上机测序及生物信息学分析，通过内参和病原的检出情况结合理论模型评估待测呼吸道样本中病原微生物的真实含量。该方法具有操作简单、方便快速、高准确度、高灵敏度等优势：
[0013](1)操作简单：只需两轮PCR反应即可完成整个建库过程，无需其它操作；
[0014](2)方便快速：相比于mNGS，tNGS从样本接收到报告仅需13h；
[0015](3)高准确度：内参引物及靶标病原特异性引物扩增建库，得到内参序列和靶标病原序列，计算呼吸道样本中病原微生物的真实载量，不受人源背景核酸影响，为呼吸道样本中病原核酸NGS测序提供更真实准确的结果；
[0016](4)高灵敏度：定量限可达100copies/mL。
附图说明
[0017]图1所示为本专利技术的靶向检测半定量方法的流程示意图；
[0018]图2所示为本专利技术的实施例五的部分病原微生物的理论浓度和实际浓度的关系图；
[0019]图3所示为本专利技术的实施例五的另一部分病原微生物的理论浓度和实际浓度的关系图；
[0020]图4为本专利技术的实施例六的原始样本中病原体的评估浓度与qPCR结果的拟合图。
具体实施方式
[0021]为详细说明本专利技术的
技术实现思路
、所实现目的及效果，以下结合实施方式并配合附图予以说明。
[0022]本专利技术最关键的构思在于：在NGS的PCR扩增中加入已知含量的内参序列，将该序列和从呼吸道样本中提取的核酸一起进行两轮PCR扩增完成文库构建、上机测序及生物信息学分析，评估待测呼吸道样本中病原微生物的真实含量。
[0023]请参照图1所示，本专利技术的一种多重PCR体系的靶向检测半定量方法，包括以下步骤：
[0024]S1：构建内参的校正系数；
[0025]S2：获得内参和靶标之间的扩增差异系数；
[0026]S3：在多重PCR体系中加入内参和待测样本一起进行扩增，经两轮多重PCR扩增后获得测序文库；
[0027]S4：对所得文库进行高通量测序，获得原始测序数据；
[0028]S5：分析原始测序数据，计算病原靶标浓度，对病原体的真实载量进行评估。
[0029]从上述描述可知，本专利技术的有益效果在于为：本专利技术提供了一种多重PCR体系的靶向检测半定量方法。具体为：(1)构建内参的校正系数：筛选出用于定量的3种内参，确定用于定量的最适内参浓度，并且明确3种内参之间的加权系数并互相校正，使内参检出更稳定均一，这是内参用于定量的基础。(2)获得内参和靶标之间的扩增差异系数：确定内参引物本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种多重PCR体系的靶向检测半定量方法，其特征在于，包括以下步骤：S1：构建内参的校正系数；S2：获得内参和靶标之间的扩增差异系数；S3：在多重PCR体系中加入内参和待测样本一起进行扩增，经两轮多重PCR扩增后获得测序文库；S4：对所得文库进行高通量测序，获得原始测序数据；S5：分析原始测序数据，计算病原靶标浓度，对病原体的真实载量进行评估。2.根据权利要求1所述的多重PCR体系的靶向检测半定量方法，其特征在于，所述S1包括以下步骤：S11：制作待测靶标引物池，将内参引物和靶标病原引物按照上下游引物分别进行等摩尔比例混合，得到上游扩增引物池和下游扩增引物池；S12：将内参序列和靶标病原序列分别稀释至不同的浓度梯度后，分别将同一浓度梯度的内参序列和靶标病原序列混合获得模板组合；S13：向所述模板组合中加入上游扩增引物池和下游扩增引物池，分别进行两轮PCR扩增后获得测序文库；S14：对测序文库进行测序、数据分析后得到内参的reads数；S15：重复S11～S14，分别得到内参IC1、内参IC2和内参IC3的检出的reads数，计算内参的校正系数，最终得到的校正系数为见式1：其中，R
IC
为内参校正后计算的reads数，R
IC1
为RPM后内参IC1的检出序列数，R
IC2
为RPM后内参IC2的检出序列数，R
IC3
为RPM后内参IC3的检出序列数。3.根据权利要求2所述的多重PCR体系的靶向检测半定量方法，其特征在于，所述内参序列的长度100～150bp、GC含量40％～60％、单种碱基占比20％～30％...

【专利技术属性】
技术研发人员：刘华勇，张盼，刘斌，杨洁，金丽君，黄诗茹，
申请(专利权)人：阿吉安福州基因医学检验实验室有限公司，
类型：发明
国别省市：