一种降低基因编辑脱靶效率的融合蛋白及其应用制造技术

本发明专利技术提供了一种降低基因编辑脱靶效率的融合蛋白及其应用，涉及生物技术领域。具体的，该融合蛋白包括蛋白表达元件、核苷脱氨酶和核酸酶，其中蛋白表达元件为小分子药物响应的蛋白表达元件FRB/FKBP。本发明专利技术首次根据ABE8e蛋白晶体结构理性设计拆分位点，通过筛选拆分位点，发现在TadA

【技术实现步骤摘要】
一种降低基因编辑脱靶效率的融合蛋白及其应用


[0001]本申请涉及生物
，尤其涉及一种降低基因编辑脱靶效率的融合蛋白及其应用。

技术介绍

[0002]目前已有研究证明，60％左右的遗传疾病由单个碱基突变引起。新一代基因编辑技术
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碱基编辑技术，可实现高效的碱基转换，为单个碱基突变引起的遗传疾病带来了治愈的希望。目前，碱基编辑技术主要代表是胞嘧啶碱基编辑技术(CBE)和腺嘌呤碱基编辑技术(ABE)，它们是由胞嘧啶脱氨酶或腺嘌呤脱氨酶与Cas9融合而成，可在基因组特定位点分别实现高效的C到T和A到G的碱基转换。目前，基于碱基编辑技术的细胞疗法已被FDA批准用于临床疾病治疗。但碱基编辑器仍存在多个技术瓶颈，如底物单一、编辑活性较低、靶向范围受限、精准度不足等，严重限制了其广泛应用。
[0003]ABE是碱基编辑器中最重要一个基础研究工具之一。目前现有被认为最高效的腺嘌呤碱基编辑器是ABE8e。然而，ABE8e仍然存在Cas9依赖的DNA脱靶及非Cas9依赖的脱靶(包括DNA脱靶和RNA脱靶)，这些为精准基因编辑带来安全困扰。因此，开发一种降低脱靶效应且维持相当靶向活性的ABE工具是本领域的迫切需要。

技术实现思路

[0004]本专利技术中，申请人根据ABE8e蛋白晶体结构理性设计拆分位点，开发了一种小分子药物诱导的可控ABE(adsBE),该ABE能够在维持相当靶向活性的同时有效地降低ABE8e的Cas9依赖的DNA脱靶及非Cas9依赖的DNA和RNA脱靶。
[0005]一方面，本申请提供了一种降低基因编辑脱靶率的融合蛋白，所述融合蛋白包括蛋白表达元件、核苷脱氨酶和核酸酶，所述蛋白表达元件为小分子药物响应的蛋白表达元件。
[0006]进一步的，所述融合蛋白的连接顺序为：所述核苷脱氨酶位于所述核酸酶的N端或C端，
[0007]所述蛋白表达元件位于所述核苷脱氨酶和所述核酸酶的N端、C端、所述核苷脱氨酶和所述核酸酶之间和/或核苷脱氨酶中间；
[0008]优选的，所述核苷脱氨酶位于所述核酸酶的N端；
[0009]更优选的，所述蛋白表达元件位于所述核苷脱氨酶中间；
[0010]更优选的，所述蛋白表达元件位于所述核苷脱氨酶第37位与第38位氨基酸中间、第47位与第48位氨基酸中间、第54位与第55位氨基酸中间、第73位与第74位氨基酸中间、第98位与第99位氨基酸中间、第107位与第108位氨基酸中间、第117位与第118位氨基酸中间、第124位与第125位氨基酸中间、第135位与第136位氨基酸中间；
[0011]更优选的，所述蛋白表达元件位于所述核苷脱氨酶第37位与第38位氨基酸中间。
[0012]本申请首次根据ABE8e蛋白晶体结构理性设计拆分位点，分别对TadA
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8e的37
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38
位点、47
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48位点、54
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55位点、73
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74位点、98
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99位点、107
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108位点、117
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118位点、124
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125位点、135
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136位点进行了拆分，并插入小分子药物响应的蛋白表达元件，发现其中37
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38位点对靶向编辑活性影响最小且可有效地降低ABE8e的Cas9依赖的DNA脱靶及非Cas9依赖的脱靶，进而获得了ABE8e蛋白中与脱靶率相关的关键位点，并给出了降低脱靶率的具体方法。
[0013]本领域技术人员可以理解的是，本申请中蛋白质编码规则遵循常用规则，以第37位为例，所述第37位即指自序列N端开始向C端方向顺序计数第37个氨基酸位点。
[0014]进一步的，所述蛋白表达元件选自雷帕霉素(Rapamycin)的FRB/FKBP诱导系统、脱落酸传感的诱导A/C二聚体系统、内含肽(intein)介导的蛋白自剪接系统的一种或多种；优选的，所述蛋白表达元件为雷帕霉素的FRB/FKBP诱导系统；更优选的，所述雷帕霉素的FRB/FKBP诱导系统包括依次顺序连接的FRB、IRES和FKBP12；更优选的，所述蛋白表达元件的氨基酸序列包括SEQ ID No.1所示序列；更优选的，编码所述蛋白表达元件的核苷酸序列包括SEQ ID No.2所示序列。
[0015]进一步的，所述脱氨酶包括胞嘧啶脱氨酶和/或腺苷脱氨酶；优选的，所述脱氨酶为腺苷脱氨酶；所述腺苷脱氨酶为细菌来源的腺苷脱氨酶；所述腺苷脱氨酶选自大肠肝菌来源的腺苷脱氨酶、金黄色酿脓葡萄球菌来源的腺苷脱氨酶、猪霍乱沙门菌来源的腺苷脱氨酶、化脓性链球菌来源的腺苷脱氨酶中的一种或多种；更优选的，所述腺苷脱氨酶为大肠肝菌来源的腺苷脱氨酶TadA
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8e；更优选的，所述腺苷脱氨酶的氨基酸序列包括SEQ ID No.3所示序列；更优选的，编码所述腺苷脱氨酶的核苷酸序列包括SEQ ID No.4所示序列。
[0016]进一步的，所述核酸酶选自Cas9、Cas3、Cas8a、Cas8b、Cas10d、Cse1、Csy1、Csn2、Cas4、Cas10、Csm2、Cmr5、Fok1、Cpf1中的一种或任意几种；优选的，所述核酸酶为Cas9；更优选的，所述Cas9选自来源于肺炎链球菌、金黄色葡萄球菌、酿脓链球菌或嗜热链球菌的Cas9；更优选的，所述Cas9选自Cas9突变体nCas9、dCas9、VQR
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spCas9、VRER
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spCas9、spCas9n；更优选的，所述Cas9为nCas9；更优选的，所述nCas9的氨基酸序列包括SEQ ID No.5所示序列；更优选的，编码所述nCas9的核苷酸序列包括SEQ ID No.6所示序列；
[0017]所述融合蛋白还包括NLS(核定位信号)；优选的，所述NLS位于所述融合蛋白的至少一端(C端和/或N端)；更优选的，所述NLS位于所述融合蛋白的两端；更优选的，所述NLS的氨基酸序列包括SEQ ID No.7所示序列；更优选的，编码所述NLS的核苷酸序列包括SEQ ID No.8所示序列。
[0018]本领域技术人员可以理解的是，所述融合蛋白NLS、蛋白表达元件、核苷脱氨酶和核酸酶之间可以增加已知的连接肽(Linker)进行连接，并且所述融合蛋白还可以进行已知的修饰，包括磷酸化、乙酰化、泛素化、糖基化等。
[0019]另一方面，本申请还提供了生物材料，所述生物材料包括下述A)
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D)中任一种：
[0020]A)一种基因，所述基因编码上述融合蛋白；所述基因为DNA或RNA(如mRNA)；
[0021]B)一种表达盒，所述表达盒含有A)所述基因；所述表达盒中还可包含启动子、终止子、标记基因等功能性元件，只要能够完成B1)所述核酸分子的表达即可；
[0022]C)一种重组载体，所述重组载体含有A)所述基因和/或B)所述表达盒；所本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种降低基因编辑脱靶率的融合蛋白，其特征在于，所述融合蛋白包括蛋白表达元件、核苷脱氨酶和核酸酶，所述蛋白表达元件为小分子药物响应的蛋白表达元件。2.根据权利要求1所述的融合蛋白，其特征在于，所述融合蛋白的连接顺序为：所述核苷脱氨酶位于所述核酸酶的N端或C端，所述蛋白表达元件位于所述核苷脱氨酶和所述核酸酶的N端、C端、所述核苷脱氨酶和所述核酸酶之间和/或核苷脱氨酶中间；优选的，所述核苷脱氨酶位于所述核酸酶的N端；更优选的，所述蛋白表达元件位于所述核苷脱氨酶中间；更优选的，所述蛋白表达元件位于所述核苷脱氨酶第37位与第38位氨基酸中间、第47位与第48位氨基酸中间、第54位与第55位氨基酸中间、第73位与第74位氨基酸中间、第98位与第99位氨基酸中间、第107位与第108位氨基酸中间、第117位与第118位氨基酸中间、第124位与第125位氨基酸中间、第135位与第136位氨基酸中间；更优选的，所述蛋白表达元件位于所述核苷脱氨酶第37位与第38位氨基酸中间。3.根据权利要求1所述的融合蛋白，其特征在于，所述蛋白表达元件选自雷帕霉素的FRB/FKBP诱导系统、脱落酸传感的诱导A/C二聚体系统、内含肽介导的蛋白自剪接系统的一种或多种；优选的，所述蛋白表达元件为雷帕霉素的FRB/FKBP诱导系统；更优选的，所述雷帕霉素的FRB/FKBP诱导系统包括依次顺序连接的FRB、IRES和FKBP12；更优选的，所述蛋白表达元件的氨基酸序列包括SEQ ID No.1所示序列；更优选的，编码所述蛋白表达元件的核苷酸序列包括SEQ ID No.2所示序列。4.根据权利要求1所述的融合蛋白，其特征在于，所述脱氨酶包括胞嘧啶脱氨酶和/或腺苷脱氨酶；优选的，所述脱氨酶为腺苷脱氨酶；所述腺苷脱氨酶为细菌来源的腺苷脱氨酶；所述腺苷脱氨酶选自大肠肝菌来源的腺苷脱氨酶、金黄色酿脓葡萄球菌来源的腺苷脱氨酶、猪霍乱沙门菌来源的腺苷脱氨酶、化脓性链球菌来源的腺苷脱氨酶中的一种或多种；更优选的，所述腺苷脱氨酶为大肠肝菌来源的腺苷脱氨酶TadA
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8e；更优选的，所述腺苷脱氨酶的氨基酸序列包括SEQ ID No.3所示序列；更优选的，编码所述腺苷脱氨酶的核苷酸序列包括SEQ ID No.4所示序列。5.根据权利要求1所述的融合蛋白，其特征在于，所述核酸酶选自Cas9、Cas3、Cas8a、Cas8b、Cas10d、Cse1、Csy1、Csn2、Cas4、Cas10、Csm2、Cmr5、Fok1、Cpf1中的一种或任意几种；优选的，所述核酸酶为Cas9；更优选的，所述Cas9选自来源于肺炎链球菌、金黄色葡萄球菌、酿脓链球菌或嗜热链球菌的Cas9；更优选的，所述Cas9选自Cas9突变体nCas9、dCas9、VQR
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spCas9、VRER
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spCas9、spCas9n；更优选的，所述Cas9为nCas9；更优选的，所述nCas9的氨基酸序列包括SEQ ID No.5所示序列；更优选的，编码所述nCas9的核苷...

【专利技术属性】
技术研发人员：张晓辉，王锦鑫，周卓，何远清，
申请(专利权)人：苏州系统医学研究所，
类型：发明
国别省市：