一种用于生产α-胡萝卜素的重组谷氨酸棒状杆菌及其构建方法技术

本发明专利技术公开了一种用于生产α

【技术实现步骤摘要】
一种用于生产
α
‑
胡萝卜素的重组谷氨酸棒状杆菌及其构建方法


[0001]本专利技术涉及α
‑
胡萝卜素生产
，特别是涉及一种用于生产α
‑
胡萝卜素的重组谷氨酸棒状杆菌及其构建方法。

技术介绍

[0002]谷氨酸棒杆菌(Corynebacterium glutamicum)是一种天然合成类胡萝卜素的革兰氏阳性细菌，由于其具备生长迅速、安全、基因组信息清晰、基因编辑工具多样等优点被广泛研究，应用于食品工业和医药产业中。
[0003]在类胡萝卜素的生物合成中，IPP(异戊烯焦磷酸)和DMAPP(二甲基烯丙基焦磷酸盐)是通用前体。在生物体内两种化合物可以经IDI(异戊基焦磷酸异构酶)的催化相互转化。然而，在谷氨酸棒状杆菌中由于IPP和DMAPP中存在反馈抑制，代谢通路过长，副产物分流和中心代谢分流等问题，现有技术中还没有类胡萝卜素大规模生物合成的案例。

技术实现思路

[0004]本专利技术的目的是针对现有技术中谷氨酸棒状杆菌中由于IPP和DMAPP中存在反馈抑制，代谢通路过长，副产物分流和中心代谢分流等问题无法大规模生物合成类胡萝卜素的问题，而提供一种用于生产α
‑
胡萝卜素的重组谷氨酸棒状杆菌。
[0005]本专利技术的另一方面，提供一种所述重组谷氨酸棒状杆菌的构建方法。
[0006]为实现本专利技术的目的所采用的技术方案是：
[0007]一种用于生产α
‑
胡萝卜素的重组谷氨酸棒状杆菌，所述重组谷氨酸棒状杆菌(Corynebacterium glutamicum)的基因组里包括ck(Choline Kinase)基因、ipk(Arabidopsis thaliana isopentenyl phosphate kinase)基因、idi(Enterobacter agglomerans isopentenyl
‑
pyrophosphate delta isomerase)基因和高表达的OluLCY表达单元，所述OluLCY表达单元包括一段单功能的ε
‑
cyclase(lcmE)和一段双功能的β
‑
cyclase(lcbB)。
[0008]在上述技术方案中，所述重组谷氨酸棒状杆菌保藏于中国普通微生物菌种保藏管理中心，保藏号：CGMCC No.26921，保藏日期：2023年3月28日，保藏地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号。
[0009]在上述技术方案中，所述ck基因、ipk基因和idi基因通过pEC
‑
IUP质粒转入所述重组谷氨酸棒状杆菌的基因组中，所述pEC
‑
IUP质粒的基因序列如SEQ ID No.1所示。
[0010]在上述技术方案中，所述OluLCY表达单元通过pZ9
‑
OlA质粒转入谷氨酸棒状杆菌的基因组中，所述pZ9
‑
OlA质粒基因高表达所述OluLCY表达单元，所述pZ9
‑
OlA质粒的基因序列如SEQ ID No.2所示。
[0011]本专利技术的另一方面，提供一种所述的重组谷氨酸棒状杆菌的构建方法，首先将所述ck基因、ipk基因和idi基因转入谷氨酸棒状杆菌的基因组得到重组谷氨酸棒状杆菌Cg
‑
IU，然后将OluLCY表达单元转入所述重组谷氨酸棒状杆菌Cg
‑
IU的基因组得到重组谷氨酸棒状杆菌Cg
‑
IUP
‑
OluLCY。
[0012]在上述技术方案中，所述方法包括以下步骤：
[0013]步骤1，分别合成pEC
‑
IUP质粒和pZ9
‑
OlA质粒；
[0014]步骤2，将pEC
‑
IUP质粒转入谷氨酸棒状杆菌，通过电转化使所述ck基因、ipk基因和idi基因转入谷氨酸棒状杆菌的基因组，重组子筛选得到重组谷氨酸棒状杆菌Cg
‑
IUP；
[0015]步骤3，将pZ9
‑
OlA质粒转入谷氨酸棒状杆菌，通过电转化使所述OluLCY表达单元转入所述重组谷氨酸棒状杆菌Cg
‑
IUP的基因组，重组子筛选得到重组谷氨酸棒状杆菌Cg
‑
IUP
‑
OluLCY。
[0016]本专利技术的另一方面，提供一种所述的重组谷氨酸棒状杆菌在发酵生产α
‑
胡萝卜素中的应用。
[0017]在上述技术方案中，所述重组谷氨酸棒状杆菌的发酵底物包括异戊烯醇。
[0018]在上述技术方案中，所述α
‑
胡萝卜素的产量不低于12.5mg/g。
[0019]在上述技术方案中，番茄红素的产量不高于2.5mg/g，δ
‑
胡萝卜素的产量不高于3.00mg/g。
[0020]与现有技术相比，本专利技术的有益效果是：
[0021]IUP(isopentenol utilization pathway)，即异戊烯醇利用途径，是一种人工的短代谢通路，可以利用异戊烯醇合成IPP。本专利技术通过实验证明，IUP与类胡萝卜素代谢途径和中心代谢途径之间互不干扰，可以高效协助生物体合成类胡萝卜素。本专利技术的重组谷氨酸棒状杆菌增加了α
‑
胡萝卜素的生物合成量，为谷氨酸棒杆菌无法大规模生产类胡萝卜素提供解决思路。
附图说明
[0022]图1所示为pEC
‑
IUP质粒的质粒图谱。
[0023]图2所示为pZ9
‑
OlA质粒的治理图谱。
[0024]图3所示为异戊烯醇对类胡萝卜素生产的影响结果图。
[0025]图4所示为实施例3和对比例1的重组谷氨酸棒状杆菌Cg
‑
IUP
‑
OluLCY生产α
‑
胡萝卜素的结果图。
具体实施方式
[0026]以下结合具体实施例对本专利技术作进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅仅用以解释本专利技术，并不用于限定本专利技术。
[0027]本专利技术所用到的谷氨酸棒杆菌(Corynebacterium glutamicum)ATCC 13032来源于实验室保藏。
[0028]本专利技术中的普通化学试剂均购自上海国药试剂集团。酵母粉、蛋白胨购自Oxiod公司。硫酸卡那霉素购自上海生工。
[0029]高保真酶、taq酶均购自于南京诺唯赞生物科技股份有限公司。Gibson组装酶购自于北京全式金生物技术有限公司。DNA纯化试剂盒、质粒小量抽提试剂盒购自于Thermo Fisher Scientific。引物合成以及基因测序由苏州金唯智公司承担。
[0030]LB培养基：5g
·
L
‑1酵母粉，10g
·
L
‑1胰蛋白胨，本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种用于生产α
‑
胡萝卜素的重组谷氨酸棒状杆菌，其特征在于，所述重组谷氨酸棒状杆菌(Corynebacterium glutamicum)的基因组里包括ck(Choline Kinase)基因、ipk(Arabidopsis thaliana isopentenyl phosphate kinase)基因、idi(Enterobacter agglomerans isopentenyl
‑
pyrophosphate delta isomerase)基因和高表达的OluLCY表达单元，所述OluLCY表达单元包括一段单功能的ε
‑
cyclase(lcmE)和一段双功能的β
‑
cyclase(lcbB)。2.如权利要求1所述的重组谷氨酸棒状杆菌，其特征在于，所述重组谷氨酸棒状杆菌保藏于中国普通微生物菌种保藏管理中心，保藏号：CGMCC No.26921，保藏日期：2023年3月28日。3.如权利要求1所述的重组谷氨酸棒杆菌，其特征在于，所述ck基因、ipk基因和idi基因通过pEC
‑
IUP质粒转入所述重组谷氨酸棒状杆菌的基因组中，所述pEC
‑
IUP质粒的基因序列如SEQ ID No.1所示。4.如权利要求1所述的重组谷氨酸棒杆菌，其特征在于，所述OluLCY表达单元通过pZ9
‑
OlA质粒转入谷氨酸棒状杆菌的基因组中，所述pZ9
‑
OlA质粒基因高表达所述OluLCY表达单元，所述pZ9
‑
OlA质粒的基因序列如SEQ ID No.2所示。5.一种如权利要求1
‑
4任意一项所述的重组谷氨...

【专利技术属性】
技术研发人员：李承，姜睿康，薛怡芸，李振，张天元，
申请(专利权)人：苏州聚维元创生物科技有限公司，
类型：发明
国别省市：