合成的DNA结合结构域及其应用制造技术

本发明专利技术的方面提供了多肽构建体，其包含：(a)包含来源于转录因子蛋白的碱性螺旋的氨基酸序列的第一多肽，所述转录因子蛋白包含碱性螺旋

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】合成的DNA结合结构域及其应用
相关申请的交叉引用
[0001]本专利申请要求2020年11月24日递交的第63/117,710号待决美国临时专利申请的权益，其通过引用整体并入本文中。关于联邦赞助的研究或开发的声明
[0002]本专利技术根据美国国立卫生研究院授予的DP2GM128199
‑
01在政府赞助下完成。政府享有本专利技术的某些权益。

技术介绍

[0003]转录因子(TFs)通过结合特异性DNA启动子和增强子序列来调节细胞状态，从而募集转录机制以激活或抑制基因表达。DNA结合是通过转录因子大家族共有的，并且在进化间保守的模块化结构域进行的。TF活性异常与人类疾病有着广泛且明确的联系。例如，许多癌症的特征是由扩增、缺失、易位或突变引起的TFs的直接遗传改变。没有这些TFs的直接改变的癌症总是依赖于失调的上游信号传导通路，其最终会影响TF功能和基因表达程序。本领域需要合成DNA结合域(sDBDs)，包括作为合成转录调节物(STRs)的那些，包括用于治疗或预防癌症。

技术实现思路

[0004]本公开的方面提供了多肽构建体，其包含：(a)第一多肽，其包含来源于转录因子蛋白的碱性螺旋的氨基酸序列，所述转录因子蛋白包含碱性螺旋
‑
环
‑
螺旋结构域；以及(b)第二多肽，其包含来源于在C端方向上从转录因子蛋白的碱性螺旋
‑
环
‑
螺旋结构域的环末端延伸的螺旋的氨基酸序列，所述转录因子蛋白包含碱性螺旋
‑
环<br/>‑
螺旋结构域；其中所述第一多肽和所述第二多肽通过多肽间的共价连接进行连接。
[0005]本公开的方面提供了多肽构建体，其包含：(a)如上所述的多肽构建体；(b)第三多肽，其包含来源于转录因子蛋白的碱性螺旋的氨基酸序列，所述转录因子蛋白包含碱性螺旋
‑
环
‑
螺旋结构域；以及(c)第四多肽，其包含来源于在C端方向上从转录因子蛋白的碱性螺旋
‑
环
‑
螺旋结构域的环末端延伸的螺旋的氨基酸序列，所述转录因子蛋白包含碱性螺旋
‑
环
‑
螺旋结构域；其中所述第三多肽和所述第四多肽通过多肽间的共价连接进行连接。
[0006]本公开的方面提供了使用本文所述的多肽构建体和多肽治疗疾病的药物组合物和方法。
[0007]本公开另外的方面如本文所述。
附图说明
[0008]图1显示了根据本公开方面的可被共价连接的如本文所述的示例性多肽内的残基的示例性位置。
[0009]图2A显示了根据本公开方面的合成支链拉链螺旋的示意图。
[0010]图2B显示了根据本公开方面的同源二聚化的示意图。
[0011]图2C显示了根据本公开方面的利用用于合成不对称的四螺旋肽缀合物的正交化学进行异源二聚化的示意图。
[0012]图2D显示了根据本公开方面的通过转换缀合化学的顺序进行异源二聚化的示意图。
[0013]图3A呈现了根据本公开方面的MYC和MAX的碱性螺旋
‑
环
‑
螺旋(bHLH)结构域的示意图。单个的单体与双链体DNA形成MYC/MAX或MAX/MAX的异源二聚体或同源二聚体复合物。来自相对的单体的B和Z螺旋的交叉二聚体连接产生非天然模拟物，其可以组装
‘
三明治
’
二聚体([B
‑
Z]2)中的四螺旋束并识别特定的DNA序列。
[0014]图3B呈现了根据本公开方面的含有二级和三级结构域稳定基团的STRs的汇聚合成。利用在用于树脂上关环复分解反应的定义位置处含有
‘
S5
’
氨基酸的双烷基化的末端烯烃，在树脂上合成B和Z螺旋。
‘
装订的
’
B螺旋在用于利用马来酰亚胺接头进行去保护和酰基化的定义C端位置处具有正交的Lys(Mmt)。装订的螺旋(这里示出的Z2和B1)在水溶液中进行连接，且易于纯化以产生约6kDa的STRs。
[0015]图4A是根据本公开方面的MAX
‑
STR的结构图示。
[0016]图4B呈现了根据本公开方面的含有螺旋稳定氨基酸、突变和螺旋间连接位点的单个碱性和拉链肽的序列。S5，(S)
‑5‑
戊烯基丙氨酸；NL，正亮氨酸；A
ib
，α
‑
氨基异丁酸；k，D
‑
赖氨酸。螺旋间连接位点(碱性螺旋最后的K；拉链螺旋的C)在这里代表经由硫醚与详细描述的STRs中相应的拉链螺旋半胱氨酸连接的碱性螺旋中的甘氨酰马来酰亚胺修饰的赖氨酸。
[0017]图4C呈现的图显示了根据本公开方面的在递增剂量的所列未标记的竞争物DN存在下，从含有恒定水平的与E
‑
box寡核苷酸探针结合的STR116、STR118和MAX/MAX的DNA竞争EMSA凝胶量化的带强度。
[0018]图5呈现的花瓣图显示了根据本公开方面的所示STRs的活性特征。
[0019]图6A的图显示了根据本公开方面的来自用FITC
‑
STR或DMSO处理的HeLa细胞的每细胞总荧光强度除以核区。每细胞值(n＝60个细胞)具有均值和s.d.，显示为实心条。
[0020]图6B的图显示了根据本公开方面的HeLa细胞中的对照和含有E
‑
box的目标基因处的内源性MYC占用的ChIP
‑
qPCR定量。IgG通过每个x轴刻度线左侧的条表示，并且Myc通过每个x轴刻度线右侧的条表示。两个独立的生物学重复的均值和s.e.m.。通过未配对双侧t检验进行统计分析。ns：不显著；*，p&lt;0.05。
[0021]图6C的图显示了根据本公开方面的P493
‑
6细胞中的对照和含有E
‑
box的目标基因处的P
‑
BioSTR118占用的光
‑
ChIP
‑
qPCR定量。生物素
‑
封闭通过每个x轴刻度线左侧的条表示，并且STR118通过每个x轴刻度线右侧的条表示。3个独立的生物学重复的均值和s.e.m.。通过未配对双侧t检验进行统计分析。ns：不显著；*，p&lt;0.05；**，p&lt;0.01。
[0022]图6D的图显示了根据本公开方面的在STR处理(24h，20μM)后测量的HCT116 E
‑
box报告细胞中的萤火虫萤光素酶活性。3个独立的生物学重复的均值和s.d.。通过未配对双侧t检验进行统计分析。*，p&lt;0.05；****，p&lt;0.0001。
[0023]图6E的图显示了根据本公开方面的在所示的每个时间点用四环素(+Tet)或用媒介物、STR116或STR118处理本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】1.多肽构建体，其包含：(a)第一多肽，其包含来源于转录因子蛋白的碱性螺旋的氨基酸序列，所述转录因子蛋白包含碱性螺旋
‑
环
‑
螺旋结构域；以及(b)第二多肽，其包含来源于在C端方向上从转录因子蛋白的碱性螺旋
‑
环
‑
螺旋结构域的环末端延伸的螺旋的氨基酸序列，所述转录因子蛋白包含碱性螺旋
‑
环
‑
螺旋结构域；其中所述第一多肽和所述第二多肽通过多肽间的共价连接进行连接。2.如权利要求1所述的多肽构建体，其中所述第一多肽的碱性螺旋包含在N端方向上从所述碱性螺旋
‑
环
‑
螺旋结构域的环开端延伸36个残基的氨基酸序列。3.如权利要求1或2所述的多肽构建体，其中所述第二多肽的螺旋包含在C端方向上从所述碱性螺旋
‑
环
‑
螺旋结构域的环末端延伸31个残基的氨基酸序列。4.如权利要求1
‑
3中任一项所述的多肽构建体，其中所述第一多肽的氨基酸序列包含一组两种非天然氨基酸，其中所述非天然氨基酸是相同的或不同的，其中所述非天然氨基酸中的每个都包括部分，其中所述部分能够进行反应而与彼此形成多肽内的共价交联，其中在形成时所述共价交联位于所述第一多肽内部。5.如权利要求1
‑
4中任一项所述的多肽构建体，其中所述第二多肽的氨基酸序列包含一组两种非天然氨基酸，其中所述非天然氨基酸是相同的或不同的，其中所述非天然氨基酸中的每个都包括部分，其中所述部分能够进行反应而与彼此形成多肽内的共价交联，其中在形成时所述共价交联位于所述第二多肽内部。6.如权利要求4或5所述的多肽构建体，其中每组非天然氨基酸都能够进行Diels
‑
Alder反应、Huisgen反应或烯烃复分解反应。7.如权利要求4或5所述的多肽构建体，其中一组内的一种非天然氨基酸是Xaa
A1
，并且所述组内的另一种非天然氨基酸是Xaa
B1
，其中R
1a
和R
1b
独立地为H、烷基、烯基、炔基、芳烷基、环烷基烷基、杂芳烷基或杂环基烷基；R
2a
和R
2b
(i)独立地为烯基、炔基、叠氮基、氨基、羧酸或硫化物，或者(ii)一起形成亚烷基、亚烯基、亚炔基或[R
3a
—X—R
3b
]
n
，其中的每个都被0
‑
6个R4取代；每个R
3a
和R3b独立地为亚烷基、亚烯基或亚炔基；每个R4独立地为卤代、烷基、OR5、N(R5)2、SR5、SOR5、SO2R5、CO2R5、R5；每个X独立地为O、S、SO、SO2、CO、CO2、CONR5或每个R5独立地为H或烷基；并且
n是整数1
‑
4。8.如权利要求4或5所述的多肽构建体，其中所述非天然氨基酸能够在反应后一起形成硫醚、醚、酰胺、胺、三唑或碳
‑
碳双键或Diels
‑
Alder加合物。9.如权利要求4或5所述的多肽构建体，其中所述非天然氨基酸独立地选自(S)
‑2‑
(4
’‑
戊烯基)丙氨酸(S5)、(R)
‑2‑
(2
’‑
丙烯基)丙氨酸(R3)和(R)
‑2‑
(7
’‑
辛烯基)丙氨酸(R8)。10.如权利要求4
‑
9中任一项所述的多肽构建体，其中所述非天然氨基酸已进行反应而与彼此形成所述多肽内的共价交联。11.如权利要求1
‑
10中任一项所述的多肽构建体，其中所述第一多肽和所述第二多肽之间的多肽间的共价连接是马来酰亚胺
‑
硫醇加合物。12.多肽构建体，其包含：(a)如权利要求1
‑
11中任一项所述的多肽构建体；(b)第三多肽，其包含来源于转录因子蛋白的碱性螺旋的氨基酸序列，所述转录因子蛋白包含碱性螺旋
‑
环
‑
螺旋结构域；以及(c)第四多肽，其包含来源于在C端方向上从转录因子蛋白的碱性螺旋
‑
环
‑
螺旋结构域的环末端延伸的螺旋的氨基酸序列，所述转录因子蛋白包含碱性螺旋
‑
环
‑
螺旋结构域；其中所述第三多肽和所述第四多肽通过多肽间的共价连接进行连接。13.如权利要求12所述的多肽构建体，其中所述第三多肽的碱性螺旋包含在N端方向上从所述碱性螺旋
‑
环
‑
螺旋结构域的环开端延伸36个残基的氨基酸序列。14.如权利要求12或13所述的多肽构建体，其中所述第四多肽的螺旋包含在C端方向上从所述碱性螺旋
‑
环
‑
螺旋结构域的环末端延伸31个残基的氨基酸序列。15.如权利要求12
‑
14中任一项所述的多肽构建体，其中所述第三多肽的氨基酸序列包含一组两种非天然氨基酸，其中所述非天然氨基酸是相同的或不同的，其中所述非天然氨基酸中的每个都包括部分，其中所述部分能够进行反应而与彼此形成多肽内的共价交联，其中在形成时所述共价交联位于所述第三多肽内部。16.如权利要求12
‑
15中任一项所述的多肽构建体，其中所述第四多肽的氨基酸序列包含一组两种非天然氨基酸，其中所述非天然氨基酸是相同的或不同的，其中所述非天然氨基酸中的每个都包括部分，其中所述部分能够进行反应而与彼此形成多肽内的共价交联，其中在形成时所述共价交联位于所述第四多肽内部。17.如权利要求15或16所述的多肽构建体，其中每组非天然氨基酸能够进行Diels
‑
Alder反应、Huisgen反应或烯烃复分解反应。18.如权利要求15或16所述的多肽构建体，其中一组内的一种非天然氨基酸是Xaa
A1
，并且所述组内的另一种非天然氨基酸是Xaa
B1
，其中
Ac
‑
HNALERKRRDHIKDSFHKLRDSVPAc
‑
KRAHHNALERKRRDHIKDSFHK(GlyMal)LRDSVP
‑
NH2Ac
‑
KRAHHNALERKRRDHIKDSFHKLRDSVPAc
‑
KRAHHNALERKRRDHIKDSFS5K(GlyMal)LRS5SVP
‑
NH2Ac
‑
KRAHHNALERKRRDHIKDSFS5KLRS5SVPAc
‑
KRAHHNALERS5RRDS5IKDSFHK(GlyMal)LRDSVP
‑
NH2Ac
‑
KRAHHNALERS5RRDS5IKDSFHKLRDSVPAc
‑
KRAHHNS5LERS5RRDHIKDSFHK(GlyMal)LRDSVP
‑
NH2Ac
‑
KRAHHNS5LERS5RRDHIKDSFHKLRDSVPAc
‑
KRA
ib
HHNALERS5RRDS5IKDSFHKLRDSVPAc
‑
KRA
ib
HHNS5LERS5RRDHIKDSFHKLRDSVPAc
‑
KRS5HHNS5LER(D
‑
lysine)RRDHIKDSFHKLRDSVPAc
‑
KRS5HHNS5LERA
ib
RRDHIKD...

【专利技术属性】
技术研发人员：雷蒙德，
申请(专利权)人：芝加哥大学，
类型：发明
国别省市：