谷氨酸棒杆菌抗逆工程菌及其在生产酸性生物基化学品中应用制造技术

本发明专利技术公开了一种具有改善抗逆性能的谷氨酸棒杆菌抗逆基因工程菌及其在生产酸性生物基化学品中应用。本发明专利技术的基于谷氨酸棒杆菌抗逆工程菌的酸性pH环境转化工艺，具有较高的底物转化率且副产物较少，制备流程简单方便，生产条件温和可控，所生产制备的α

【技术实现步骤摘要】
谷氨酸棒杆菌抗逆工程菌及其在生产酸性生物基化学品中应用


[0001]本专利技术属于生物技术和合成生物学领域，涉及一种谷氨酸棒杆菌抗逆基因工程菌的构建方法，以及其在生产α
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酮戊二酸等酸性生物基化学品中应用。

技术介绍

[0002]谷氨酸棒杆菌（Corynebacterium glutamicum）是一种重要的食品安全级工业微生物菌种，已被广泛用于多种氨基酸的工业发酵，以及有机酸、核苷酸和维生素等的生物合成，具有重要的经济价值和应用前景[ Lee JY, Na YA, Kim E, et al. The ActinobacteriumCorynebacterium glutamicum, an Industrial Workhorse. J MicrobiolBiotechnol, 2016, 26: 807
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22.]。但是在工业发酵条件下，例如发酵生产谷氨酸及其衍生物等酸性生物基化学品时，谷氨酸棒杆菌时常面临着诸多的生理或非生理逆境胁迫，严重影响菌种的正常生理状态以及相关目标产物的高效积累，其中低酸胁迫等是比较常见的环境胁迫压力[Guan N, Li J, Shin H, et al. Microbial response to environmental stresses: from fundamental mechanisms to practical applications. ApplMicrobiolBiotechnol, 2017, 101: 3991
‑r/>4008.]。高性能的微生物菌种是发酵工程的基础，也是提高生物发酵产品产量和质量的重要保障，拥有优良稳定抗逆表型的工程微生物对于实现更高的发酵产量、产率和生产强度是必需的。因此，在深入理解谷氨酸棒杆菌对工业复杂发酵环境的生理适应机制基础上，利用合成生物学等策略和工具对谷氨酸棒杆菌进行生理性能调控，提高菌株在逆境胁迫下的代谢能力和耐受性能，进而充分发挥其工业价值，具有重要的理论研究和现实指导意义。
[0003]目前，氨基酸产业仍以传统大宗的中低档产品为主，高附加值氨基酸衍生物产品的开发和生产亟待加强，围绕生物医药、生物饲料、生物环保等，通过生物转化等方法，开发氨基酸产业下游高附加值产品，对于进一步扩大和延伸氨基酸产业链条，实现可持续发展具有重要意义。α
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酮戊二酸（α
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ketoglutarate, α
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KG）是一种重要的有机酸，在有机体细胞碳
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氮代谢中发挥着重要作用，也是合成多种糖类、氨基酸以及蛋白质等的重要前体物质，在食品、医药、饲料、精细化工和化妆品等行业中都具有广阔的应用前景[Wu N, Yang M, Gaur U, et al. Alpha
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ketoglutarate: physiological functions and applications. BiomolTher, 2016, 24: 1
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8.]。目前传统工艺多采用化学合成法生产α
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KG，包括草酸类乙酯水解法或酰基氰化物水解法等，但是化学合成法由于条件苛刻、能耗大且得率低，合成工艺中会使用大量氰化物、重金属离子、强酸强碱等有害试剂，严重限制该方法在医药、化妆品和食品等行业的应用。相比于化学合成法，基于发酵法生产α
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KG具有生产原料丰富、成本较低、得率较高等优点，但是由于发酵过程产生过多的丙酮酸、富马酸、苹果酸等副产物，并且存在生产菌种资源匮乏、发酵产量偏低、发酵周期过长等不利因素，尚不能满足大规模工业生产的需要。生物转化法由于具有操作简便、条件温和、原料利用率高、转化率高且易分离纯化等优势，在大幅节约生产成本和解决谷氨酸产能过剩方面具有重要应用需求。
[0004]L
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谷氨酸氧化酶（L
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glutamate oxidase, LGOX）能够高效的催化L
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谷氨酸转化生成高附加值产品α
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KG，是生物转化法生产α
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KG的关键酶制剂[Niu P, Dong X, Wang Y, et al. Enzymatic production of alpha
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ketoglutaric acid from L
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glutamic acid via L
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glutamate oxidase. J Biotechnol, 2014, 179: 56
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62.]。LGOX介导的催化反应具有反应条件温和、催化效率高、底物特异性强及环境友好等诸多优势，已被广泛应用于食品、医药、化工及环保等领域。但是由于酶活性普遍较低，最适活性pH偏酸性，并且稳定性较差，实际应用受到很大影响。2017年，申请人课题组以筛选具有潜在高活性的LGOX为出发点，发掘和鉴定出多个不同来源的LGOX，后续通过L
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谷氨酸氧化酶诱导性培养基进行复筛后，获得一株具有优良L
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谷氨酸氧化酶催化活性的链霉菌[Liu Q, Ma X, Cheng H, et al. Co
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expression of L
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glutamate oxidase and catalase in Escherichia coli to produce alpha
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ketoglutaric acid by whole
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cell biocatalyst. Biotechnol Lett, 2017, 39: 913
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919.]。将来源于链霉菌X的L
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谷氨酸氧化酶基因在E. coliBL21中进行克隆表达和纯化，粗酶活性达到125.7 U/mg，远远高于目前已知的L
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谷氨酸氧化酶。酶学性质研究发现，该酶最适反应pH 6.0，最适反应温度35
°
C，但是酶的热稳定性稍差，当反应温度高于45
ꢀ°
C时，LGOX酶活会急剧下降。尽管该酶稍有瑕疵，但是其优良的催化活性潜力，为后续开发α
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KG高效生物转化制备技术奠定了重要基础。

技术实现思路

[0005]基于以上认识，本专利技术的主要目的在于提供一种具有优良抗逆性能的谷氨酸棒杆菌抗逆基因工程菌，同时利用该工程菌设计构建高效微生物细胞工厂，能够实现在低pH胁迫环境条件下高效制备α
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酮戊二酸等酸性生物基化学品。
[0006]优良生物功能元件的挖掘、表征和标准化是合成生物学研究的基石，也是构建高效抗逆微生物底盘的前提。本专利技术通过测试谷氨酸棒杆菌（Corynebacterium glutamicumATCC 13032）已报道的抗逆候选基因，以及挖掘来源于（Escherichia coliMG1655）、短乳杆菌（Lacto本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种谷氨酸棒杆菌抗逆基因工程菌，其特征在于，其是将低酸高度特异性响应启动子控制下的抗酸基因元件导入谷氨酸棒杆菌出发菌中而获得。2.如权利要求1所述的谷氨酸棒杆菌抗逆基因工程菌，其特征在于，所述低酸高度特异性响应启动子是来源于谷氨酸棒杆菌的Pcg2796；所述抗酸基因元件来源于短乳杆菌Cfa ，其GenBank登录号为ABJ65104.1、谷氨酸棒杆菌Dps ，其GenBank登录号为CAF18940.1、嗜酸性氧化亚铁硫杆菌GroES，其GenBank登录号为ACK77997.1，极端嗜热古菌TK2097 ，其GenBank登录号为BAD86286.1。3.如权利要求1所述的谷氨酸棒杆菌抗逆基因工程菌，其特征在于，所述出发菌是谷氨酸棒杆菌将野生型谷氨酸棒杆菌，或者将其通过低酸环境下胁迫条件进行传代培养获得的驯化菌，其在低酸环境条件下的菌体生物量高于野生菌。4.如权利要求1至 3任一项所述的谷氨酸棒杆菌抗逆基因工程菌，其特征在于，在所述出发菌中共表达谷氨酸氧化酶和过氧化氢酶获得的基因工程菌，以实现α
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KG的一步法合成。5.如权利要求4所述的谷氨酸棒杆菌抗逆基因工程菌，其特征在于，所述谷氨酸氧化酶是L
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谷氨酸氧化酶或其突变体，所述突变体是指在来源于茂源链霉菌野生型L
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谷氨酸氧化酶基础上，将其第280位氨基酸由丝氨酸S突变为苏氨酸T，或者第533位氨基酸由组氨酸H突变为亮氨酸L；所述过氧化氢酶是大肠杆菌过氧化氢酶。6.如权利要求4所述的谷氨酸棒杆菌抗逆基因工程菌，其特征在于，进一步...

【专利技术属性】
技术研发人员：刘君，徐宁，
申请(专利权)人：中国科学院天津工业生物技术研究所，
类型：发明
国别省市：