提供一种测量未分级的大分子溶液的分子性质的新方法。跨越一定浓度范围的样品等分试样被顺序地注射到溶液流中并且流向检测器。由此每等分试样产生有效的“峰”，其要素相应于不同浓度的稀释的等分试样。溶液中大分子的重均摩尔质量、均方半径和第二位力系数是由整个相应峰中散射信号的角度和浓度依赖性分析而得到的。与较早的在线方法相比，在使用较小量样品时，获得更佳的准确度。还提供用于测定两种截然不同种类的大分子之间的交叉位力系数的类似方法。
【技术实现步骤摘要】
技术介绍
0001溶液中的分子一般被表征为其重均摩尔质量M、其均方半 径々/〉 = p鈿/p附(这里r是与该分子的质心的距离并且^n是那个距离处的小体积的质量)和第二位力系数(维里系数，virial coefficient)」2。在一些情况中，第三位力系数^也是关心的。在其它 情况中，两个截然不同的分子A和B之间的交叉位力系数j/s是关心 的。M和々/〉是溶液中全部分子求平均的单个分子的性质，位力系数 是溶剂所介导的分子间平均相互作用的度量。对于未分级的溶液来说， 这些性质可以通过利用Bruno Zimm在他1948年学术论文(seminal 1948 paper)——其出现在Journal of Chemical Physics,第16巻，第 1093至1099页——中描述的方法测量它们散射光的方式而测定。从小 体积的溶液中散射的光在一定范围的角度和浓度内进行测量。在一定 范围的散射角内光散射数据的收集更常见地被称为多角度光散射， MALS。由单一种类分子的光散射测量得到的性质通过Zimm研究的方 程表达并且由W.A. J. Bryce在Po(ym" 10 804-809 (1969)进行修正 * (c，0) = Mc尸(。-2^2 2 -2 c3 (1)其中/ ,，0=/^,0/尺*， i (c，0是每单位立体角在方向0上所测量的超瑞 利比(excess Rayleigh ratio),其被定义为i ((9)=[/,(0-/,。/v(6^2/[/0KJ， /,(0是溶液所散射的光的强度，其为角的函数，/,。/v(0作为角的函数是 从溶剂中散射的光的强度，/。是入射强度，r是从散射体积到检测器的 距离，r是检测器所见的照明体积，尺=4兀2 "浐/f^义力，并且尺* = 7q^"/c/c)2， A^是阿伏加德罗常数(Avogadro's number), ^/dc是折光率 增量，"。是溶剂折光率，并且々是真空中入射光的波长。iY②是散射分 子的形状因子，其被定义为尸(^="^^及W/i 仰。尸(^的一般形式通 过R Debye在J. Phys. Colloid Chem., 51 18 (1947)得到，为，=1-尸>2〔昏、+尸，sin"、^+尺 (2)2 乂A与均方半径有关A,)2并且A-2;z/A，其中义是溶剂中入射光的波长。尸2与均方半径々g、和均四次方半径(the mean quadri-radius)< 4>有关P2= ! iorg" - 3〈 "。该方程是基于浓度和sin2(6>/2)的幂的级数展开的近似；因为如此，精确程度取决于高次项的相对大 小。进行该测试的标准方法，也被称为"平稳方法(平台方法 plateau method)",涉及制备一系列具有增加浓度的已知值的样品；将 样品顺序地导入MALS检测器，不管是通过在光束中插入含有该样品 的玻璃瓶还是通过将样品注射到位于该光束中的流动池中；借助光检 测器获得每个角度处的散射强度；计算每个浓度和角度的超瑞利比； 并且将该数据拟合到方程(1)以求出M、 <r/〉、 ^和爿3。來W)《d"、+乂c c^ 乂(3)0012各种种类的在线浓度检测器是已知的，其包括紫外可见吸 光度、荧光和差示折光率dRI检测器。dRI检测器与光散射测量联合是 特别有用的，并且足够通用以测量宽范围的可溶性大分子。dRI测量的 一个缺点是需要相对于溶剂完全透析蛋白样品，这恰恰因为dRI检测 器对可能存在于蛋白样品但不存在于纯缓冲液的盐和赋形剂以及溶解 的气体敏感。图4是溶解于PBS的BSA的传统席姆图，其基于图3的 平稳数据和通过将平稳方法应用于图4的数据而进行的标准分析。 1.1理论描述2Avmj;和 光散射峰,j光散射蜂,j方程(5)可被重写为M2」22^ . 2「。「"尸2 . 4一,——^sin一34 445_兄 —组初始浓度d、 c2、 ... q的样品按顺序注射到一组检测 器中~~MALS检测器，其包含多个角度沐下的光检测器，以及浓度 检测器，诸如附图说明图1中所示。MALS检测器的 一 个实例是DAWN-HELEOS，来自Wyatt Technology Corporation, Santa Barbara, CA，浓度检测器的实例是Optilab rEX，也来自Wyatt Technology Corporation。在一般的实施方式中，浓度系列符合cm=mZlc，其中m取 1至n的整数值并且Zlc是固定的浓度跃迁(concentration step)。真实的 峰浓度将因为在流过该系统过程中样品峰稀释和变宽，与初始值不同。 借助泵使得样品连续流过检测器。随着样品穿过检测器，数据由进行 前述拟合程序的计算机从检测器中获得，储存并且分析。在图1所示的被称为"注射阀方法"的第一实施方式中， 溶剂通过泵工具1从溶剂储罐2中抽出穿过脱气装置3，并且然后泵过 过滤工具4进入注射阀11并且通到检测器8和9中。脱气装置3 —般 用于从溶剂中去除溶解的气体，因为这种气体可能随后在溶液中产生 可能干扰溶液本身期望测量的小气泡。过滤工具4 一般如所示被并入 以便从所述溶剂中去除可能干扰期望测量的残余颗粒物质。泵工具的 一个实例是型号G1310等度泵(恒溶剂泵，isocratic pump)，其来自 Agilent Technologies, Inc., Santa Clara, CA。脱气装置的实例是Systec多 通道真空脱气装置(Systec Multi-Channel Vacuum Degasser)，其可从 Upchurch Scientific, Oak Harbor, WA得到。溶剂穿过设定在旁路位置的 注射阀ll，以便溶剂没有流过样品回路12。注射阀的实例是型号7725 分析注射器，其也来自Upchurch Scientific样品5的等分试样一一其 重均摩尔质量、均方半径以及第二和第三位力系数通过本专利技术的方法 得到—通过注射器工具6转移到样品回路12中。当样品转移完成时，注射阀换到注射位置以便溶剂流过样品回路12，这样溶剂将样品携带 至检测器8和9。不同浓度可以预先制备并且手工注射到样品回路中。 可选地，它们可以预先制备并且借助自动取样器注入。在优选的实施 方式中，商业自动取样器诸如1329A——其也来自Agilent Technologies, Inc——被设定程序以通过在小瓶中混合不同体积的储备溶液和溶剂而 从样品储备溶液中产生多种浓度。在另一优选实施方式中，多种浓度 通过对自动取样器设定程序以将不同体积的储备溶液直接注射到样品 回路中而产生，其中样品回路被充以溶剂，并且注射体积小于回路体 积，以至于通过在样品回路中混合而发生稀释。优先地，样品浓度将 跨越一个数量级或更大。0041在图2所示的被称为"复式泵方法"的第二实施方式中， 两台计算机控制的泵21a禾卩21b——例如Microlab 500 Dual-Syringe Diluter/Dispenser(复式注射稀释器/分配器)，Hamilton Corp., Reno, NV， 其包括两个独立的可控注射泵(syringe pump)——被用于从本文档来自技高网...
【技术保护点】
一种测定溶剂中分子的溶液的平均分子性质的方法，其包括下列步骤： Ａ．提供所述溶剂的储罐； Ｂ．提供所述溶液的储罐； Ｃ．用所述溶剂采用稀释工具从所述储罐制备一系列所述溶液的ｎ稀释液Ｄ↓［ｍ］（ｍ＝１，ｎ）； Ｄ．提供 取样工具，通过所述取样工具所述稀释液Ｄ↓［ｍ］（ｍ＝１，ｎ）被按顺序注射并且使其逐次流过 ａ．光散射检测器，其收集在所述稀释液Ｄ↓［ｍ］（ｍ＝１，ｎ）的每个增加的注射体积Δｖ↓［ｉ］下在多个ｑ角度θ↓［ｋ］（ｋ＝１，ｑ）散射的光； ｂ．浓度检测器，其测量在所述稀释液Ｄ↓［ｍ］（ｍ＝１，ｎ）的每个增加的注射体积Δｖ↓［ｉ］下相应的分子浓度ｃ↓［ｍｉ］（ｍ＝１，ｎ）；和 Ｅ．从在每个流动体积增加的间隔Δｖ↓［ｉ］下测量的散射光强度和所述相应的分子浓度ｃ↓［ｍｉ］ 中产生相关的超瑞利比Ｒ（θ↓［ｋ］，ｃ↓［ｍｉ］）； Ｆ．在各个所述稀释液ｍ的整个洗脱中，从所述收集的浓度数据值ｃ↓［ｍｉ］计算与所述稀释液Ｄ↓［ｍ］相应的ｎ个和Ｃ↓［ｍ］＝＊ｃ↓［ｍｉ］Δｖ↓［ｉ］，其中ｍ＝１至ｎ； Ｇ．从所 述产生的超瑞利比Ｒ＊（θ↓［ｋ］，ｃ↓［ｍｉ］）计算与所述ｎ个稀释液相应的３ｑｍ超瑞利比和，Ｒ↓［１，ｍｉ］＝＊［Ｒ＊（θ↓［ｋ］，ｃ↓［ｍｉ］）］Δｖ↓［ｉ］，（ｋ＝１，ｑ；ｍ＝１，ｎ），Ｒ↓［２，ｍｋ］＝＊［Ｒ＊（θ↓［ｋ］，ｃ↓［ｍｉ］）］↑［２］Δｖ↓［ｉ］和Ｒ↓［３，ｍｋ］＝＊［Ｒ＊（θ↓［ｋ］，ｃ↓［ｍｉ］）］↑［３］Δｖ↓［ｉ］； Ｈ．通过用下列方程拟合所述数据从所述３ｑｎ超瑞利比和获取所述分子溶液的所述平均性质 Ｃ↓［ｍｋ］＝１／ＭＲ↓［１，ｍｋ］ ＋Ｐ↓［１］／Ｍｓｉｎ↑［２］（θ／２）Ｒ↓［１，ｍｋ］－Ｐ↓［２］／Ｍｓｉｎ↑［４］（θ／２）Ｒ↓［１，ｍｋ］＋２Ａ↓［２］／ＭＲ↓［２，ｍｋ］＋２Ａ↓［２］Ｐ↓［１］／Ｍｓｉｎ↑［２］（θ／２）Ｒ↓［２，ｍｋ］＋（３Ａ↓［３］／Ｍ＋４Ａ↓［２］↑［２］／Ｍ↑［２］）Ｒ↓［３，ｍｋ］ 其中Ｐ↓［１］＝４κ↑［２］／３〈ｒ↓［ｇ］↑［２］〉，Ｐ↓［２］＝２κ↑［４］／４５（１０〈ｒ↓［ｇ］↑［２］〉↑［２］－３〈ｒ↓［ｇ］↑［４］〉），ｋ＝２πｎ↓［０］／λ↓［０］，ｎ ↓［０］是溶剂的折光率，并且λ↓［０］是所述光散射检测器的入射真空波长。...
【技术特征摘要】
...
【专利技术属性】
技术研发人员：DI萨姆，SP特拉伊诺夫，
申请(专利权)人：怀亚特技术公司，
类型：发明
国别省市：US[美国]
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