肝微粒体中1-羟基咪达唑仑浓度的UPLC-MS/MS分析检测方法技术

本发明专利技术提供一种肝微粒体中1

【技术实现步骤摘要】
肝微粒体中1
‑
羟基咪达唑仑浓度的UPLC
‑
MS/MS分析检测方法


[0001]本专利技术涉及药物检测
，具体而言涉及一种肝微粒体中1
‑
羟基咪达唑仑浓度的UPLC
‑
MS/MS分析检测方法。

技术介绍

[0002]肝微粒体酶又称肝药酶，该系统中的主要酶系为CYP450，CYP450酶系参与生物体内源性和外源性物质的生物转化，是参与药物代谢的主要酶系，包括CYP1、CYP2、CYP3、CYP4、CYP5、CYP7和CYP8等亚族。CYP3A4是CYP450s酶系的重要亚组，在肝脏和小肠中表达最丰富，参与50％以上临床药物的I相代谢。因此，研究CYP3A4酶代谢对评价药物代谢特征及研究药物
‑
药物之间相互作用起着重要的作用。
[0003]CYP3A4酶活性的改变，会使经其代谢的药物在体内的代谢减慢或增加，从而导致血药浓度的改变，反映出药物作用效果的强弱的改变甚至是否产生毒性。因此，在评价药物代谢过程中研究CYP3A4酶活性的改变具有十分重要的意义，目前主要利用体外方法进行药物代谢研究，研究代谢酶对底物的选择性代谢和底物对酶的诱导或抑制，预测体内潜在的药物相互作用等，从而可有效缩短药物研发周期。
[0004]在CYP3A4代谢酶研究中，咪达唑仑经CYP3A4代谢酶M位点代谢，主要代谢产物为1
‑
羟基咪达唑仑。在国内外相关文献咪达唑仑作为CYP3A4的特征性探针底物，通过测定其在肝微粒体中其主要代谢产物1
‑
羟基咪达唑仑的含量变化，对CYP3A4代谢酶的活性进行评价。
[0005]在体外代谢抑制研究过程中，常用评价酶活性体外方法为探针药物法即Cocktail鸡尾酒疗法，该方法通过建立肝微粒体温孵体系，建立药物代谢研究模型。但Cocktail法采用同一个孵育体系，统一终止反应时间，不能很好地控制每个酶的反应程度，很容易出现反应过量的现象。
[0006]目前报道定量检测咪达唑仑代谢物的方法有高效液相色谱，其检测方法大都为梯度洗脱，检测物质多，分离度欠佳，且操作和样品预处理方法较为繁琐，难以实现对人肝微粒体温孵体系中1
‑
羟基咪达唑仑与咪达唑仑及其代谢产物的有效分离，无法对其进行准确定量，且定量下限较高、线性范围窄及灵敏度低等；同时文献报道的还有高效液相串联质谱检测法(LC
‑
MS/MS法)，但方法中为梯度洗脱、分析检测时间较长等，无法实现1
‑
羟基咪达唑仑的单独检测或分析检测时间长等。
[0007]因此，有必要建立一种更快速、更稳定、灵敏度高及线性范围更大分离检测方法。

技术实现思路

[0008]本专利技术目的在于针对现有提供一种肝微粒体中1
‑
羟基咪达唑仑浓度的UPLC
‑
MS/MS分析检测方法，该检测方法灵敏度高，稳定精确，且提高了分析效率。
[0009]为实现上述目的，本专利技术所采用的技术方案如下：
[0010]一种肝微粒体中1
‑
羟基咪达唑仑浓度的UPLC
‑
MS/MS分析检测方法，其特征在于，
包括以下具体步骤：
[0011]S1、建立肝微粒体温孵体系
[0012]在PBS缓冲溶液中加入混合的人肝微粒体、氯化镁溶液，以及底物预孵育，之后加入还原型辅酶Ⅱ启动反应，在恒温水浴锅中温孵；
[0013]S2、标准曲线样品及待测样品的配制
[0014]根据步骤S1中的肝微粒体温孵体系，配制系列浓度的标准曲线样品、质控样品及空白样品，并进行孵育；其中，底物为系列浓度的1
‑
羟基咪达唑仑；
[0015]根据S1中的肝微粒体温孵体系，配制待测样品，并进行孵育，其中底物为浓度0.5μM的咪达唑仑。
[0016]S3、样品进样前处理
[0017]在步骤S2中孵育后的标准曲线样品和待测样品中加入内标物终止反应，并进行涡旋振荡、离心，之后取离心后的上清液至孔板中，每孔中加入乙腈水溶液复溶，并进行封膜、摇板；
[0018]S4、UPLC
‑
MS/MS分析检测
[0019]将步骤S3处理后的样品进行UPLC
‑
MS/MS分析检测，其中，
[0020]UPLC检测条件：
[0021]流动相A：0.1％甲酸水溶液；流动相B：0.1％甲酸乙腈溶液；
[0022]洗针液：异丙醇/甲醇/乙腈/超纯水混合液，体积比为1:3:3:3；
[0023]色谱柱：ACQUITY UPLC HSS T3；
[0024]流速：0.4mL/min
[0025]保留时间：1
‑
羟基咪达唑仑：0.59min；非那西汀：0.82min；
[0026]洗脱时间：1.5min
[0027]色谱洗脱程序为：0～1.5min流动相B的体积百分数为40％；
[0028]质谱条件为：
[0029]质谱离子源：Turbo Spray电喷雾电离源；极性：正离子模式；扫描类型：MRM多反应离子监测；碰撞气：Medium；气帘气：35psi；分辨率Q1/Q3：Unit/Unit；喷雾气：50psi；辅助加热气：50psi；喷雾电压：5500V；离子化温度：500℃；采集时长：1.50min；
[0030]根据检测结果得到1
‑
羟基咪达唑仑的标准曲线，并根据标准曲线得到待测样品中的1
‑
羟基咪达唑仑浓度。
[0031]优选的，所述步骤S1中，人肝微粒体的孵育浓度为0.01mg/mL，氯化镁溶液的孵育浓度为10mM，还原型辅酶Ⅱ的孵育浓度为1mM；预孵育时间为5min，启动反应后，在37℃恒温水浴锅中的孵育时间为25min。
[0032]优选的，所述步骤S2中，标准曲线样品浓度范围为0.005μM～5μM。
[0033]优选的，所述步骤S3中，内标工作溶液为100ng/mL的非那西汀；乙腈水溶液的质量分数为50％，上清液和乙腈水溶液的体积比为1:2；
[0034]前处理的条件如下：以2500rpm的转速涡旋振荡5min；在4℃的条件下，以12000rpm的转速离心10min；以300rpm的转速摇板5min。
[0035]优选的，所述步骤S4中，色谱柱的规格为：长50mm
×
内径2.1μm，填充颗粒1.8μm。
[0036]优选的，所述步骤S4中，UPLC检测条件中进样量为2μL。
[0037]优选的，所述步骤S4中，UPLC检测条件中进样时间为1.5min。
[0038]优选的，所述步骤S4中，UPLC检测条件中，柱温为40℃，自动进样器的温度为4℃。
[0039]优选的，所述步骤S4中，离子监测采集参数如下：
[0040]1‑
羟基咪达唑本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种肝微粒体中1
‑
羟基咪达唑仑浓度的UPLC
‑
MS/MS分析检测方法，其特征在于，包括以下具体步骤：S1、建立肝微粒体温孵体系在PBS缓冲溶液中加入混合的人肝微粒体、氯化镁溶液，以及底物预孵育，之后加入还原型辅酶Ⅱ启动反应，在恒温水浴锅中温孵；S2、标准曲线样品及待测样品的配制根据步骤S1中的肝微粒体温孵体系，配制系列浓度的标准曲线样品、质控样品及空白样品等，并进行孵育；其中，底物为系列浓度的1
‑
羟基咪达唑仑；根据S1中的肝微粒体温孵体系，配制待测样品，并进行孵育，其中底物为浓度0.5μM的咪达唑仑；S3、样品进样前处理在步骤S2中孵育后的标准曲线样品和待测样品中加入内标工作溶液终止反应，涡旋、振荡、离心，后取离心后的上清液至孔板中，每孔中加入乙腈水溶液复溶，封膜、摇板；S4、UPLC
‑
MS/MS分析检测将步骤S3处理后的样品进行UPLC
‑
MS/MS分析检测，其中，色谱检测条件：流动相A：0.1％甲酸水溶液；流动相B：0.1％甲酸乙腈溶液；洗针液：异丙醇/甲醇/乙腈/超纯水混合液，体积比为1:3:3:3；色谱柱：ACQUITY UPLC HSS T3；流速：0.4mL/min保留时间：1
‑
羟基咪达唑仑：0.59min；非那西汀：0.82min；洗脱时间：1.5min色谱洗脱程序为：0～1.5min、流动相B的体积百分数为40％；质谱条件为：质谱离子源：Turbo Spray电喷雾电离源；极性：正离子模式；扫描类型：MRM多反应离子监测；碰撞气：Medium；气帘气：35psi；分辨率Q1/Q3：Unit/Unit；喷雾气：50psi；辅助加热气：50psi；喷雾电压：5500V；离子化温度：500℃；采集时长：1.50min；根据检测结果得到1
‑
羟基咪达唑仑的标准曲线，并根据标准曲线得到待测样品中的1
‑
羟基咪达唑仑浓度。2.根据权利要求1所述的肝微粒体中1
‑
羟基咪达唑仑浓度的UPLC
‑
MS/MS分析检测方法，其特征在于，所述步骤S1中，人肝微粒体的孵育浓度为0.01mg/mL，氯化镁溶液的孵育浓度为10mM，还原型辅酶Ⅱ的孵育浓度为1mM；预孵育时间为5min，启动反应后，在37℃恒温水浴锅中的孵育时间为25min。3.根据权利要求1所述的肝微粒体中1

【专利技术属性】
技术研发人员：樊阿莉，何孟奇，胡惠影，张雪峰，程远国，窦金辉，
申请(专利权)人：江苏鼎泰药物研究集团股份有限公司，
类型：发明
国别省市：