本发明专利技术涉及一种能够以高特异性扩增非常低浓度的靶核酸的靶核酸扩增方法，以及使用该方法的靶核酸扩增组合物，更具体地，涉及通过与靶核酸(如果存在)结合的导向探针和能够与导向探针结合并扩增靶核酸的部分引物以高特异性产生靶核酸扩增子的方法，以及用于实施该方法的聚合酶链式反应(PCR)组合物。根据本发明专利技术的靶核酸扩增方法甚至能够扩增以非常低的浓度存在的靶核酸，因为利用导向探针结合样品中存在的任何可杂交的核酸，同时有助于部分引物结合靶核酸的检测位点。此外，由于部分引物的序列特异性导致除靶核酸之外的核酸的扩增速率的差异，具有可以以高特异性检测靶核酸的优点，该方法可用于分子诊断、产前诊断、早期诊断、癌症诊断、遗传相关诊断、遗传性状诊断、感染性细菌的诊断、耐药性细菌的鉴别、法医学和生物物种的分类。生物物种的分类。生物物种的分类。
【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】具有高特异性的靶核酸扩增方法和使用其的靶核酸扩增组合物
[0001]本专利技术涉及一种扩增靶核酸的方法，该方法能够以高特异性扩增非常低浓度的靶核酸，以及使用该方法扩增靶核酸的组合物，更具体地，涉及一种以高特异性生成靶核酸扩增子的方法，该方法使用与靶核酸结合的导向探针和能够与导向探针结合以当靶核酸存在时扩增靶核酸的部分引物，以及用于实施该方法的聚合酶链式反应(PCR)的组合物。
技术介绍
[0002]地球上所有活生物体的遗传信息是每种活生物体独特性质的来源，包括腺嘌呤(A)、鸟嘌呤(G)、胞嘧啶(C)、胸腺嘧啶(T)和尿嘧啶(U)的碱基，它们依次记录在一种称为“核酸”(DNA或RNA)的物质中。因此，揭示或鉴定这些碱基的序列(核苷酸序列)可能是用于鉴定活生物体的性质和理解其固有代谢机制的过程。
[0003]最近，通过检测或鉴定活生物体的特定核苷酸序列来确定活生物体的存在或性质的分子诊断学已被广泛使用。药学上使用的分子诊断学的代表性实例包括用于检测与人类癌症相关的基因突变、检测导致可能发生在人类中的传染性疾病的病原体以及检测存在于其他食物中的有害微生物的测试。
[0004]用于特异性鉴定特定核苷酸序列的各种分子诊断技术大多使用聚合酶链式反应(PCR)，该反应使用核酸聚合酶(DNA聚合酶)。聚合酶链式反应使用一种组合物和一种称为“热循环仪”的装置进行，该组合物包含一对引物和热稳定的核酸聚合酶，所述引物可以与包含特定核苷酸序列区域的靶核酸特异性杂交，所述热稳定的核酸聚合酶能够使用靶核酸作为模板，基于所述引物作为触发物，引起聚合酶链式反应，以及该装置可以以逐步和重复的方式对该组合物施加预定的温度。此外，通过聚合酶链式反应的分子诊断利用核酸结合染料或探针来实时检测在大量产生(扩增)的靶核酸中的特定核苷酸序列，这被称为“实时聚合酶链式反应(实时PCR)”。
[0005]在分子诊断中需要高灵敏度和高特异性来检测与人类癌症相关的基因突变。原因在于，由于待检测的突变对应于体细胞突变，如果在与未突变(野生型)正常DNA非常少量混合且与正常基因的核苷酸序列没有显著差异的点突变中，或者在具有复杂核苷酸序列突变的插入/缺失突变和基因融合突变中，不能准确识别靶突变，则可能产生假阳性。
[0006]换句话说，对肿瘤特异性突变检测试验的主要要求是：(1)检测在正常DNA中以低比例存在的突变型DNA的灵敏度，和(2)将使导致正常DNA被错误确定为突变型DNA的假阳性错误最小化的特异性。
[0007]已经开发并使用了用于检测肿瘤特异性突变的各种测试方法，代表性方法包括直接测序、等位基因特异性PCR(AS
‑
PCR)、限制性片段长度多态性(RFLP)、TaqMan探针法和ARMS(扩增阻滞突变系统)PCR。然而，这些方法没有表现出令人满意的灵敏度和特异性。直接测序具有最高的特异性，因此假阳性率低，但其缺点是仅当存在超过20％至30％的突变型DNA时才能检测。同时，AS
‑
PCR、RFLP和TaqMan探针法具有高灵敏度，但是由于特异性低，
仍然存在假阳性的问题。
[0008]最近，高特异性的测序分析逐渐受到重视。例如，灵敏度和特异性大大提高的方法，诸如PNA(肽核酸)介导的钳制PCR(PCR clamping)(Sun,X.等人,2002.Nat Biotechnol,20:186
‑
189)、LNA(锁核酸)
‑
介导的钳制PCR(Dominguez,P.L.,等人,2005.Oncogene,24:6830
‑
6834)、COLD
‑
PCR(在较低变性温度下的共扩增PCR)(Li,J.,等人,2008.Nat.Med,14:579
‑
584)等已经被开发出来。
[0009]为了提高特异性，特异性低是AS
‑
PCR的缺点，开发了ARMS
‑
PCR。ARMS
‑
PCR是基于只有当引物具有与模板序列完全互补的序列时才进行PCR(如AS
‑
PCR)的原理的。(Newton,C.R.,等人,1989.Nucl Acids Res,17；2503
‑
2516)。为了确定具有优异特异性的最佳引物，不利的是，实验性试错法是不可避免的(Drenkard,E.,等人,2000.Plant Physiol.124:1483
‑
1492)。
[0010]因此，本专利技术人努力开发了一种方法，该方法可以显著提高以非常低的浓度存在的靶核酸的扩增的特异性。结果，本专利技术人发现，当通过使用能够与靶核酸的不同于检测位点的位点杂交的导向探针、包含与导向探针的不同于靶核酸杂交位点的位点结合的序列和与靶核酸检测位点结合的序列的部分引物以及与部分引物配对以扩增靶核酸的特异性引物产生扩增产物来进行PCR时，可以以高特异性检测非常低浓度的靶核酸，并基于此完成了本专利技术。
[0011]在该
技术介绍
部分中公开的信息仅仅是为了更好地理解本专利技术的背景而提供的，因此它可能不包括形成对本领域技术人员来说已经显而易见的现有技术的信息。
技术实现思路
[0012]因此，本专利技术的一个目的是提供一种以高特异性扩增非常低浓度的靶核酸的方法。
[0013]本专利技术的另一个目的是提供一种用于扩增靶核酸的聚合酶链式反应(PCR)组合物，其能够以高特异性扩增非常低浓度的靶核酸。
[0014]根据本专利技术的一个方面，上述和其他目的可以通过提供一种扩增靶核酸的方法来实现，该方法包括(a)将从样品中分离的核酸与以下混合：i)导向探针，其能够与靶核酸的不同于检测位点的位点杂交，
[0015]ii)部分引物，其包括与导向探针的不同于靶核酸杂交位点的位点结合的序列和与靶核酸的检测位点结合的序列，和
[0016]iii)特异性引物，其能够与部分引物配对以扩增靶核酸并进行聚合酶链式反应(PCR)，以及
[0017](b)确定是否存在扩增产物。
[0018]根据本专利技术的另一方面，提供了用于扩增靶核酸的PCR组合物，其包括i)导向探针，其能够与靶核酸的不同于检测位点的位点杂交，ii)部分引物，其包括与导向探针的不同于靶核酸杂交位点的位点结合的序列和与靶核酸检测位点结合的序列，和iii)特异性引物，其与部分引物配对以扩增靶核酸。
附图说明
[0019]图1例示了本专利技术一种实施方式所需的导向探针、部分引物、特异性引物和组分之间的杂交关系。
[0020]图2示出了根据本专利技术的由于靶核酸和非靶核酸之间的核苷酸序列差异而使扩增效率差异最大化的原理，更具体地，(a)示出了由于与靶核酸杂交的本专利技术的部分引物的部分的长度小，导致核苷酸序列错配的杂交效率差异大，导致正常DNA和突变型DNA之间扩增效率差异的最大化，和(b)示出了由于与靶核酸杂交的常规引物的部分的长度很大，导致由核苷酸序列错配引起的杂交效率差异很小，因此本文档来自技高网...
【技术保护点】
【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】1.一种扩增靶核酸的方法，包括:(a)将从样品中分离的核酸与以下混合：i)导向探针，其能够与所述靶核酸的不同于检测位点的位点杂交；ii)部分引物，其包括与所述导向探针的不同于靶核酸杂交位点的位点结合的序列和与所述靶核酸的所述检测位点结合的序列；和iii)特异性引物，其能够与所述部分引物配对以扩增所述靶核酸，并进行聚合酶链式反应(PCR)；以及(b)确定是否存在扩增产物。2.根据权利要求1所述的方法，其中，所述导向探针与所述靶核酸杂交的位点存在于5
’
端或N
‑
末端，而所述导向探针与所述部分引物杂交的位点存在于3
’
端或C
‑
末端。3.根据权利要求1所述的方法，其中，所述导向探针进一步包括在所述导向探针与所述靶核酸杂交的位点和所述导向探针与所述部分引物杂交的位点之间的接头。4.根据权利要求3所述的方法，其中，所述接头包括选自由以下组成的组的至少一者：β
‑
丙氨酸(β
‑
Ala
‑
OH，C3)、氨基丁酸(C4)、氨基己酸(C6)、氨基月桂酸(C12)、丙烯酸乙酰乙酰氧乙酯(AAEA(O
‑
接头))、氨基乙氧基乙氧基乙氧基乙酸(2
‑
[2
‑
[2
‑
(氨基)乙氧基]乙氧基]乙氧基]乙酸，AEEEA)、AEEEEA、DL15和L35。5.根据权利要求1所述的方法，其中，所述导向探针、所述部分引物和所述特异性引物包括寡核苷酸、LNA(锁核酸)、PNA(肽核酸)或其混合物。6.根据权利要求5所述的方法，其中，所述导向探针是具有核苷酸序列长度为10至500的PNA。7.根据权利要求6所述的方法，其中，所述导向探针是具有核苷酸序列长度为20至150的PNA。8.根据权利要求1所述的方法，其中，所述导向探针与和所述特异性引物杂交的所述靶核酸的一条链的相对链杂交。9.根据权利要求1所述的方法，其中，所述部分引物进一步包括作为单链寡核苷酸的间...
【专利技术属性】
技术研发人员：朴在振，南孝周，金珉彻，李英，
申请(专利权)人：帕纳金股份有限公司，
类型：发明
国别省市：
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