AGPG在作为内分泌耐药雌激素受体阳性乳腺癌治疗靶点中的应用制造技术

本发明专利技术公开AGPG在作为内分泌耐药雌激素受体阳性乳腺癌治疗靶点中的应用，本发明专利技术通过稳定敲除的研究发现，AGPG能够促进体外内分泌抵抗细胞周期进展和细胞增殖。最后基于小干扰RNA的药物在体内实验中进行了测试，进一步证明小干扰RNA介导的AGPG的下调显著抑制他莫昔芬耐药MCF7异种移植物的生长。芬耐药MCF7异种移植物的生长。

【技术实现步骤摘要】
GTATAGCTTAACGTAGGCATTTTTTTG
‑
3'(SEQ ID NO.3)；
[0013]shRNA2
‑
AGPG：5'
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CCGGAAGACTTTGTTAACCGTTCCCTCTCG AGGTATAGCTTAACGTAGGCATTTTTTTG
‑
3'(SEQ ID NO.4)。
[0014]本专利技术所述的小干扰RNA可以按照本领域的常规方法制得，也可以进一步被胆固醇修饰。
[0015]本专利技术技术方案之三在于AGPG抑制剂可以与其他抗雌激素类药物联合使用，在作为治疗乳腺癌药物中的应用。在一些实施例中，所述的乳腺癌为内分泌耐药雌激素受体阳性乳腺癌。
[0016]在另一些实施例中，所述乳腺癌为耐药性内分泌耐药雌激素受体阳性乳腺癌。所述耐药性可以为原发性也可以为获得性耐药性，通常是指抗内分泌药物的耐药性，例如他莫昔芬耐药雌激素受体阳性乳腺癌或者氟维司群耐药雌激素受体阳性乳腺癌。AGPG抑制剂可以如前所述。
[0017]本专利技术所述的抗雌激素类药物为本领域常用的抗刺激素类药物，包括但不限于他莫昔芬或氟维司群。
[0018]本专利技术所述的AGPG抑制剂与其他抗雌激素类药物可以同时服用，也可以先后服用，所用剂量可以选用本领域常规的治疗有效量的剂量。
[0019]本专利技术敲除AGPG显著抑制了MCF7及T47D乳腺癌细胞的增殖。在携带他莫昔芬耐药MCF7异种移植物的裸鼠中进一步证实以上发现，注射胆固醇修饰的AGPG siRNA有力地抑制了异种移植物的生长。该研究充分证明敲除AGPG对治疗乳腺癌，特别是内分泌耐药雌激素受体阳性乳腺癌有效，抑制效果明显。即AGPG可以作为乳腺癌，特别是内分泌耐药雌激素受体阳性乳腺癌的治疗靶点。
附图说明
[0020]图1为细胞系敲低结果图，其中图A为MCF7、T47D细胞系中用shRNA对AGPG进行敲低的结果图，结果显示shRNA可以显著降低MCF7、T47D细胞中AGPG的表达量。其中图B为他莫昔芬、氟维司群耐药的MCF7细胞系中用shRNA对AGPG进行敲低的结果图，结果显示shRNA可以显著降低他莫昔芬、氟维司群耐药的MCF7细胞中AGPG的表达量。
[0021]图2为细胞增殖和集落形成实验结果图；其中图(A
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B)为细胞增殖实验结果图，结果显示AGPG shRNA抑制MCF7、T47D、他莫昔芬、氟维司群耐药MCF7的细胞增殖。图C为集落形成实验结果图，图D为图C的数量统计图；图E为集落形成实验结果图，图F为图E的数量统计图，实验结果图，结果显示AGPG shRNA抑制MCF7、T47D细胞的集落形成。
[0022]图3为细胞周期结果图；图(A
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B)为流式细胞术检测实验结果图，结果显示AGPG shRNA导致MCF7、T47D细胞G0/G1期升高。
[0023]图4为肿瘤生长结果图；图(A
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B)为小鼠成瘤大小统计图，结果显示AGPG shRNA、胆固醇修饰AGPG siRNA有力地抑制了裸鼠体内肿瘤的生长。
具体实施方式
[0024]以下结合附图和实施例对本专利技术进一步说明，以下实施例便于更好地理解本专利技术，但并不限定本专利技术。
[0025]下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的试验材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
[0026]本专利技术所用生物材料、试剂和试剂盒等均可以通过常规商业购买得到，所用实验技术均为本领域内的常规操作或参照相应商品的说明书进行操作。
[0027]若无特别说明，以下实施例所用的MCF7、T47D、293T细胞系购自美国类型培养库(ATCC、Manassas、V A)。
[0028]若无特别说明，以下实施例中他莫昔芬或氟维司群耐药MCF7细胞亚系的构建方法为：通过在不含酚红/谷氨酰胺的RPMI1640培养基(Biological Industries，Beit Haemek，Israel)中培养MCF7细胞，并添加10％炭脱胎牛血清(Biological Industries)、GlutaMax(Gibco)；开始按照0.1，0.2，1μM梯度浓度依次增加他莫昔芬(Selleck，Houston，TX)或按照0.01，0.05，0.1μM梯度浓度依次增加氟维司群(Selleck)，每种浓度持续4个月，共培养12个月，所得细胞即为他莫昔芬或氟维司群耐药MCF7细胞亚系。他莫昔芬或氟维司群耐药MCF7细胞亚系继续维持在上述1μM他莫昔芬或0.1μM氟维司群的培养基中，未特别说明的其他条件同常规MCF7细胞的培养。
[0029]实施例1：敲低AGPG的MCF7、T47D、他莫昔芬、氟维司群耐药MCF7细胞系的构建
[0030]1、AGPG敲低细胞系的建立
[0031]根据长链非编码RNA(lncRNA)AGPG序列按照常规方法设计敲低AGPG表达的shRNA，本实施例所用的shRNA靶序列如下表1：
[0032]表1
[0033][0034]AGPG的全长和shRNA由GeneWiz(Suzhou,China)合成并连接到pLVX
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PURO和pLKO载体上。(pLVX
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PURO和pLKO购自Addgene)形成重组载体pLVX
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PURO
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AGPG或pLKO.1
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shRNA。
[0035]2、细胞慢病毒感染
[0036]通过Lipofectamine 3000试剂(Invitrogen；Thermo Fisher Scientific)将质粒psPAX2、pDM2.G和pLVX
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PURO
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AGPG或pLVX
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PURO或pLKO.1
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AGPG
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shRNA1或pLKO.1
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Ctr shRNA(Ctr shRNA序列如SEQ ID NO.5)共转染到293T细胞中。转染后24小时收获第一批慢病毒，在转染后48小时收获第二批慢病毒。
[0037]3、感染
[0038]MCF7、T47D、他莫昔芬、氟维司群耐药MCF7细胞在含有慢病毒的培养基中培养24小时，用含有2μg/mL嘌呤霉素(Thermo Fisher Scientific)的完全培养基培养48小时，获得AGPG敲低的MCF7、T47D、他莫昔芬、氟维司群耐药MCF7细胞系。
[0039]4、RT
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qPCR验证
[0040]用TRNzol Universal(TIANGEN)试剂提取步骤3感染的MCF7、T47D、他莫昔芬、氟维
司群耐药MCF7细胞总RNA。用NanoDrop2000分光光度计测量RNA的浓度和质量。用HiScript II第一链cDNA本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.AGPG在作为乳腺癌治疗靶点中的应用，AGPG序列如SEQ ID NO.1所示。2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述的乳腺癌为内分泌耐药雌激素受体阳性乳腺癌；优选的，所述的乳腺癌为他莫昔芬耐药雌激素受体阳性乳腺癌或者氟维司群耐药雌激素受体阳性乳腺癌。3.AGPG抑制剂在制备治疗乳腺癌药物中的应用，AGPG序列如SEQ ID NO.1所示。4.根据权利要求3所述的应用，其特征在于，所述的乳腺癌为内分泌耐药雌激素受体阳性乳腺癌；优选的，所述的乳腺癌为他莫昔芬耐药雌激素受体阳性乳腺癌或者氟维司群耐药雌激素受体阳性乳腺癌。5.AGPG抑制剂和抗雌激素类药物在联合制备治疗乳腺癌药物中的应用。6.根据权利...

【专利技术属性】
技术研发人员：余诗奕，吴瑞，孙海波，
申请(专利权)人：南京捷因诊断技术有限公司，
类型：发明
国别省市：