一种提高PET降解酶表达量的方法技术

本发明专利技术公开了一种提高PET降解酶表达量的方法，属于蛋白质工程和发酵工程技术领域。本发明专利技术所述方法涉及一种产酶促进剂胞二磷胆碱，具体步骤如下：含PET水解酶表达质粒的重组菌在发酵产酶过程中添加0.01～1mM胞二磷胆碱，其产酶量得到极大的提升。本发明专利技术为PET降解酶的高产提供一个有效的策略，操作工艺简单，且成本较低，效果显著，为工业化制备奠定了基础。为工业化制备奠定了基础。为工业化制备奠定了基础。

【技术实现步骤摘要】
NO.8所示，所述水解酶Est119的核苷酸序列如SEQ ID NO.10所示。
[0009]在本专利技术的一种实施方式中，所述重组细胞是以真菌或细菌为表达宿主。
[0010]在本专利技术的一种实施方式中，所述重组细胞是以pET系列载体、Duet系列载体、pGEX系列载体、pHY300载体、pHY300PLK载体、pPIC3K载体或pPIC9K系列载体为表达载体。
[0011]在本专利技术的一种实施方式中，所述重组细胞是以大肠杆菌、毕赤酵母、枯草芽孢杆菌或酿酒酵母为表达宿主。
[0012]在本专利技术的一种实施方式中，所述重组细胞的构建方法为，将编码PET水解酶的基因连接至表达载体上，再将表达载体转入大肠杆菌中得到的。
[0013]在本专利技术的一种实施方式中，所述胞二磷胆碱盐包括但不限于胞二磷胆碱钠盐。
[0014]在本专利技术的一种实施方式中，所述重组细胞以大肠杆菌为宿主。
[0015]在本专利技术的一种实施方式中，所述大肠杆菌为E.coli BL21(DE3)。
[0016]在本专利技术的一种实施方式中，所述胞二磷胆碱的添加量为0.01
‑
1mM。
[0017]在本专利技术的一种实施方式中，所述体系中还含有蛋白胨10g/L，酵母粉24g/L，甘油5g/L，K2HPO4·
3H2O 16.43g/L，KH2PO
4 2.31g/L，卡那霉素30mg/L。
[0018]在本专利技术的一种实施方式中，将重组细胞培养得到种子液，将种子液接种至发酵的体系中，在转速200rpm、温度37℃，培养2h后，加入终浓度为0.1mM诱导剂IPTG，并将温度调至25℃，培养24h。
[0019]本专利技术还提供了一种增加PET降解酶在重组细胞中的表达量的产品，所述产品中含有胞二磷胆碱或胞二磷胆碱盐。
[0020]在本专利技术的一种实施方式中，所述PET降解酶包括但不限于，来源于Thermobifida fusca的角质酶TfC、来源于Bacterium HR29的水解酶BhrPETase、来源于Leaf
‑
branch compost的角质酶LCC、来源于Ideonella sakaiensis的水解酶IsPETase、来源于Thermobifida alba的水解酶Est119。
[0021]在本专利技术的一种实施方式中，所述角质酶TfC的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示，所述水解酶BhrPETase的氨基酸序列如SEQ ID NO.3所示，所述角质酶LCC的氨基酸序列如SEQ IDNO.5所示，所述水解酶IsPETase的氨基酸序列如SEQ ID NO.7所示，所述水解酶Est119的氨基酸序列如SEQ ID NO.9所示。
[0022]在本专利技术的一种实施方式中，编码所述T.fusca来源的角质酶TfC的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示，编码所述水解酶BhrPETase的核苷酸序列如SEQ ID NO.4所示，所述角质酶LCC的核苷酸序列如SEQ ID NO.6所示，所述水解酶IsPETase的核苷酸序列如SEQ ID NO.8所示，所述水解酶Est119的核苷酸序列如SEQ ID NO.10所示。
[0023]在本专利技术的一种实施方式中，所述重组细胞是以真菌或细菌为表达宿主。
[0024]在本专利技术的一种实施方式中所述重组细胞是以pET系列载体、Duet系列载体、pGEX系列载体、pHY300载体、pHY300PLK载体、pPIC3K载体或pPIC9K系列载体为表达载体。
[0025]在本专利技术的一种实施方式中，所述重组细胞是以大肠杆菌、毕赤酵母、枯草芽孢杆菌、酿酒酵母为表达宿主。
[0026]在本专利技术的一种实施方式中，所述重组细胞的构建方法为：将PET降解酶的编码基因连接至表达载体上，再将重组表达载体转入宿主细胞中。
[0027]在本专利技术的一种实施方式中，所述胞二磷胆碱盐包括但不限于胞二磷胆碱钠盐。
[0028]本专利技术提供了一种在含有胞二磷胆碱或胞二磷胆碱盐的体系中培养重组细胞来制备PET降解酶的方法。
[0029]在本专利技术的一种实施方式中，所述胞二磷胆碱盐包括但不限于胞二磷胆碱钠盐。
[0030]在本专利技术的一种实施方式中，所述重组细胞为，将编码PET降解酶的基因连接至表达载体上，再将重组表达载体转入大肠杆菌中得到的。
[0031]在本专利技术的一种实施方式中，所述体系中，胞二磷胆碱或胞二磷胆碱盐的含量为0.01
‑
1mM。
[0032]在本专利技术的一种实施方式中，所述方法为，在重组细胞发酵产酶期间的0
‑
12h之间向体系中添加胞二磷胆碱或胞二磷胆碱盐。
[0033]在本专利技术的一种实施方式中，所述PET水解酶包括但不限于，来源于Thermobifida fusca的角质酶TfC、来源于Bacterium HR29的水解酶BhrPETase、来源于Leaf
‑
branch compost的角质酶LCC、来源于Ideonella sakaiensis的水解酶IsPETase、来源于Thermobifida alba的水解酶Est119。
[0034]在本专利技术的一种实施方式中，所述T.fusca来源的角质酶TfC的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示，所述水解酶BhrPETase的氨基酸序列如SEQ ID NO.3所示，所述角质酶LCC的氨基酸序列如SEQ ID NO.5所示，所述水解酶IsPETase的氨基酸序列如SEQ ID NO.7所示，所述水解酶Est119的氨基酸序列如SEQ ID NO.9所示。
[0035]在本专利技术的一种实施方式中，编码所述T.fusca来源的角质酶TfC的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示，编码所述水解酶BhrPETase的核苷酸序列如SEQ ID NO.4所示，所述角质酶LCC的核苷酸序列如SEQ ID NO.6所示，所述水解酶IsPETase的核苷酸序列如SEQ ID NO.8所示，所述水解酶Est119的核苷酸序列如SEQ ID NO.10所示。
[0036]在本专利技术的一种实施方式中，所述重组菌是以真菌或细菌为表达宿主。
[0037]在本专利技术的一种实施方式中，所述重组细胞是以大肠杆菌、毕赤酵母、枯草芽孢杆菌或酿酒酵母为表达宿主。
[0038]在本专利技术的一种实施方式中，所述重组细胞以大肠杆菌为宿主。
[0039]在本专利技术的一种实施方式中，所述大肠杆菌为E.coli BL21(DE3)。
[0040]在本专利技术的一种实施方式中，所述体系中还含有蛋白胨10g/L，酵母粉24g/L，甘油5g/L，K2HPO4·
3H2O 16.43g/L，KH2PO
4 2.31g/L，卡那霉素30mg/L。
[0041]在本专利技术的一种实施方式中，将重组细胞培养得到种子液，将种子液接种至发酵的体系中，在转速200rpm、温度37℃，培养2h后，加入终浓度本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种增加PET降解酶在重组细胞中的表达量的方法，其特征在于，将表达PET降解酶的重组细胞在含有胞二磷胆碱或胞二磷胆碱盐的体系中进行发酵培养。2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述PET降解酶包括但不限于，来源于Thermobifida fusca的角质酶TfC、来源于Bacterium HR29的水解酶BhrPETase、来源于Leaf
‑
branch compost的角质酶LCC、来源于Ideonella sakaiensis的水解酶IsPETase、来源于Thermobifida alba的水解酶Est119。3.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，所述角质酶TfC的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示，所述水解酶BhrPETase的氨基酸序列如SEQ ID NO.3所示，所述角质酶LCC的氨基酸序列如SEQ ID NO.5所示，所述水解酶IsPETase的氨基酸序列如SEQ ID NO.7所示，所述水解酶Est119的氨基酸序列如SEQ ID NO.9所示。4.根据权利要求3所述的方法，其特征在于，所述重组细胞是以真菌或细菌为表达宿主。5.根据权利要求4所述的方法，其特征在于，所述重组细胞是以pET系列载体、Duet系列载体、pGEX系列载体、pHY300载体、pHY300PLK载体、pPIC3K载体或pPIC9K系列载体为表达载体。6.根据权利要求5所述的方法，其特征在于，所述重组细胞是以大肠杆菌、毕赤酵母、枯草芽孢杆菌工艺酿酒酵母为表达宿主。7.根据权利要求1～6任一项所述的方法，其特征在于，所述胞二磷胆碱盐包括但不限于：胞二磷胆碱钠盐。8.一种增加PET降解酶在重组细胞中的表达量的产品，其特征在于，所述产品中含有胞二磷胆碱或胞二磷胆碱盐。9.根据权利要求8所述的产品，其特征在于，所述PET降解酶包括但不限于，来源于Thermobifida fusca的角质酶TfC、来源于Bacterium HR29的水解酶BhrPETase、来源于Leaf
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branch compost的角质酶LCC、来源于Ideonella sakaiensis的水解酶IsPETase、来源于Thermobifida alba的水解酶Est119。10.根据权利要求9所述的产品，其特征在于，所述角质酶TfC的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示，所述水解酶BhrPETase的氨基酸序列如SEQ ID NO.3所示，所述角质酶LCC的氨基酸序列如SEQ ID NO.5所示，所述水解酶IsPETase的氨基酸序列如SEQ ID NO.7所示，所述水解酶Est11...

【专利技术属性】
技术研发人员：吴敬，颜正飞，陈晓倩，徐翰，
申请(专利权)人：江南大学，
类型：发明
国别省市：