用于改善色素沉着的基因修饰外泌体及其制备方法与应用技术

本发明专利技术涉及外泌体生物技术领域，尤其是涉及一种用于改善色素沉着的基因修饰外泌体及其制备方法与应用；一种用于改善色素沉着的基因修饰外泌体，基因修饰外泌体为过表达miR

【技术实现步骤摘要】
用于改善色素沉着的基因修饰外泌体及其制备方法与应用


[0001]本专利技术涉及外泌体生物
，尤其是涉及一种用于改善色素沉着的基因修饰外泌体及其制备方法与应用。

技术介绍

[0002]皮肤的色素沉着是表皮黑色素细胞数量增多和活性增强导致的，黑色素细胞的胞浆内合成黑色素的量在miRNA水平受精确的调控。现有文献表明miR
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5p可与酪氨酸酶家族的TYR
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mRNA靶向结合，抑制其分泌黑色素的能力。现有文献中报道了miR
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5p对小鼠黑色素细胞的抑制效果，利用脂质体将miR
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5p导入小鼠角质形成细胞，从培养上清中分离过表达miR
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5p的外泌体；该研究利用角质形成细胞外泌体可以大量被黑素细胞摄取的特性，提出了一条皮肤美白的创新性思路。
[0003]现有技术中在研究miR
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5p对小鼠黑色素细胞的抑制效果时，治疗目标使用的是小鼠黑色素细胞，治疗药物使用的是miR
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5p过表达的小鼠角质形成细胞来源的外泌体，虽然疗效确切，但是否适用于人类仍有待验证。
[0004]现有技术中在研究miR
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5p对小鼠黑色素细胞的抑制效果，所用的细胞为角质形成细胞，属于成熟体细胞，缺点是：（1）获取不易：需要切割大量皮肤才能获取；（2）分离方法繁琐：需要在无实验室用胶原酶消化，对设备要求较高；（3）体外扩增困难：已近分化末期，不能像干细胞一样传代数十次。
[0005]因此，从培养上清中提取基因修饰外泌体在动物层面做机制研究尚可，但是工业化量产用于人类使用难以实现；另外，如果使用表皮干细胞系，类似肿瘤细胞，与原代人脂肪MSC相比有携带肿瘤基因的风险。
[0006]现有技术中只做了细胞学研究，没有做动物研究，离临床转化仍有较远距离；因此，如何实现基因修饰外泌体工业化量产成为迫切需要解决的问题。

技术实现思路

[0007]针对现有技术存在的不足，本申请提供用于改善色素沉着的基因修饰外泌体及其制备方法与应用。
[0008]第一方面，本申请提供一种用于改善色素沉着的基因修饰外泌体，采用如下的技术方案：一种用于改善色素沉着的基因修饰外泌体，所述基因修饰外泌体为过表达miR
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5p基因修饰的间充质干细胞外泌体。
[0009]优选的，间充质干细胞为脂肪间充质干细胞。
[0010]第二方面，本申请提供一种用于改善色素沉着的基因修饰外泌体的制备方法，采用如下的技术方案：一种用于改善色素沉着的基因修饰外泌体的制备方法，包括以下步骤：
（1）构建miR
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5p基因的过表达载体；（2）将miR
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5p基因的过表达载体转染293T细胞，进行慢病毒包装，收集上清；（3）将收集的上清转染间充质干细胞；（4）用嘌呤霉素筛选转染阳性的间充质干细胞，并扩大培养，收集上清，提取得到过表达miR
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5p基因修饰的间充质干细胞外泌体。
[0011]优选的，步骤（1）中miR
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5p基因的过表达载体的构建方法如下：将miR
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5p基因、绿色荧光蛋白筛选标记和嘌呤霉素抗性基因连接在慢病毒载体上，得到miR
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5p基因的过表达载体。
[0012]优选的，miR
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5p基因的过表达载体的核苷酸序列如SEQ ID No.1所示。
[0013]优选的，绿色荧光蛋白筛选标记的核苷酸序列如SEQ ID No.2所示。
[0014]优选的，嘌呤霉素抗性基因的核苷酸序列如SEQ ID No.3所示。
[0015]本申请中公开了一种用于改善色素沉着的基因修饰外泌体的制备方法，通过将miR
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5p基因通过慢病毒转染MSC后，从培养上清中提取外泌体；与脂质体或电转染相比，本申请中采用的慢病毒转染MSC属于稳定转染，细胞核内的miR
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5p基因可随MSC的扩增长期存在，形成稳定的工业化大量生产，从而可以实现工业化制备外泌体。
[0016]第三方面，本申请提供一种基因修饰外泌体在制备用于改善色素沉着的药物中的应用，采用如下的技术方案：上述的基因修饰外泌体（过表达miR
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5p基因修饰的间充质干细胞外泌体）在制备用于改善色素沉着的药物中的应用。
[0017]第四方面，本申请提供一种基因修饰外泌体在制备用于改善色素沉着的化妆品中的应用，采用如下的技术方案：上述的基因修饰外泌体（过表达miR
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5p基因修饰的间充质干细胞外泌体）在制备用于改善色素沉着的化妆品中的应用。
[0018]在一个具体的可实施方案中，一种用于改善色素沉着的基因修饰外泌体的制备方法，包括以下步骤：（1）从整形美容机构获取无菌的脂肪抽取物，在实验室用胶原酶溶解，贴壁培养3天获取脂肪MSC，用细胞工厂大量扩增；（2）将miR
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5p基因序列（如SEQ ID No.4）、绿色荧光蛋白筛选标记（如SEQ ID No.2）和嘌呤霉素抗性基因（如SEQ ID No.3）的序列都连接在慢病毒载体上，得到miR
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5p基因的过表达载体（如SEQ ID No.1所示），将得到的miR
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5p基因的过表达载体在293T细胞中进行慢病毒包装，从293T细胞培养上清获取包装好的携带miR
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5p的慢病毒，
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20℃保存；（3）将携带miR
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5p的慢病毒加入MSC培养体系，感染MSC使其胞浆过表达miR
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5p，持续用嘌呤霉素筛选直至全部MSC都表达绿色荧光，得到过表达miR
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5p的MSC，将得到过表达miR
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5p的MSC与未转染的MSC在mRNA水平上表达强度进行比对，当过表达miR
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5p的MSC为高强度表达时，再继续扩大培养，并开始持续收集培养上清，...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种用于改善色素沉着的基因修饰外泌体，其特征在于：所述基因修饰外泌体为过表达miR
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5p基因修饰的间充质干细胞外泌体。2.根据权利要求1所述的一种用于改善色素沉着的基因修饰外泌体，其特征在于：间充质干细胞为脂肪间充质干细胞。3.一种制备权利要求1或2所述用于改善色素沉着的基因修饰外泌体的方法，其特征在于，包括以下步骤：（1）构建miR
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5p基因的过表达载体；（2）将miR
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5p基因的过表达载体转染293T细胞，进行慢病毒包装，收集上清；（3）将收集的上清转染间充质干细胞；（4）筛选转染阳性的间充质干细胞，并扩大培养，收集上清，提取得到过表达miR
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5p基因修饰的间充质干细胞外泌体。4.根据权利要求3所述的方法，其特征在于，步骤（1）中miR
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【专利技术属性】
技术研发人员：陈继冰，王雪莹，
申请(专利权)人：广州四叶草健康科技有限公司，
类型：发明
国别省市：