本发明专利技术公开了一种检测TRPC6 mRNA水平的引物组、试剂盒、检测方法及在阿尔兹海默病诊断中的用途，引物组对应于TRPC6基因mRNA的第1至第2外显子区或第8至第9外显子区或第11至第13外显子区。检测TRPC6 mRNA水平的试剂盒包括TRPC6基因的PCR扩增引物组、肌动蛋白Actin内参基因的PCR扩增引物组、TRPC6目的基因校准品、Actin内参基因校准品、PCR扩增反应液体系和反转录酶。检测方法为：提取RNA样本，进行PCR扩增检测，以Actin mRNA为内参，计算RNA样本中TRPC6 mRNA与Actin mRNA的浓度比值，作为检测结果。本发明专利技术的检测引物特异性高，检测方法对于阿尔兹海默症诊断具有精准、效费比高、便捷等特点，具有重大的临床意义。具有重大的临床意义。具有重大的临床意义。
【技术实现步骤摘要】
检测TRPC6 mRNA水平的引物组、试剂盒、检测方法及在阿尔兹海默病诊断中的用途
[0001]本专利技术属于生物医学检测
，具体涉及一种用于检测TRPC6 mRNA水平的引物组、试剂盒、检测方法及在阿尔兹海默病诊断中的用途。
技术介绍
[0002]阿尔茨海默病 (Alzheimer
’
s disease，AD)，即老年痴呆症，是老年人群中引起痴呆的最常见的神经系统退行性疾病。AD起病隐匿，临床表现主要是渐进性的认知功能和日常生活能力下降。依靠医生问诊和神经心理学测试，主观性较强，医生的临床经验和神经心理学测试是否规范会对诊断的准确性造成影响，又如影像学检查MRI、PET
‑
CT检测费用昂贵，脑脊液检测（CSF）创伤性强，因此AD诊断迫切需要有客观，准确和效费比高的生物标记物。
[0003]瞬时受体电位通道（TRPC）是非选择性阳离子通道，其功能主要是感应一系列物理或化学信号，被激活后开放，引起钙、钠等离子内流，从而使细胞和机体对外界环境作出应答。TRPC通道家族有七个成员，即TRPC1~TRPC7。人类TRPC6基因定位于第11号染色体，含有13个外显子，编码931个氨基酸。在神经系统中，TRPC6也发挥着重要作用：TRPC6在脑缺血过程中对神经元有保护作用。有研究表明，TRPC6与神经系统，神经元，学习记忆和AD毒性蛋白Aβ的产生有直接的关系，外周血中TRPC6 mRNA含量是个有高度应用价值的、有较好特异性和相关性的、适合诊断AD的生物标记物。
[0004]专利文献CN103966309A公开了一种检测外周血细胞TRPC6 mRNA水平的方法，先提取总RNA再反转录，最后进行PCR扩增来判断TRPC6 mRNA水平。但是该检测方法采用多步反应，容易累积系统误差，另一方面测得的是TRPC6 mRNA相对表达水平，这些都会降低检测结果准确性，从而影响对受试者阿尔兹海默病的判断。专利文献CN113881765A也公开了一种检测TRPC6表达产物的方法，用于2型糖尿病的早期诊断和预后评估，但该方法中RT
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PCR和qPCR过程分开，也容易扩大系统误差，对检验操作有较高的要求。发展一种准确性更高的检测TRPC6 mRNA水平的方法对于临床诊断阿尔兹海默病具有重要意义。
技术实现思路
[0005]有鉴于此，本专利技术提供的目的之一在于提供一种检测TRPC6 mRNA水平的试剂盒。
[0006]其技术方案如下：一种检测TRPC6 mRNA水平的试剂盒，其关键在于，包括瞬时受体电位通道6 TRPC6基因的PCR扩增引物组、肌动蛋白Actin内参基因的PCR扩增引物组、TRPC6目的基因校准品、Actin内参基因校准品、PCR扩增反应液体系和反转录酶；所述TRPC6基因的PCR扩增引物组包括如下引物组中的至少一组：核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示的上游引物TPS
‑1‑
F，核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示的下游引物TPS
‑1‑
R；
核苷酸序列如SEQ ID NO.5所示的上游引物TPS
‑3‑
F，核苷酸序列如SEQ ID NO.6所示的下游引物TPS
‑3‑
R；核苷酸序列如SEQ ID NO.7所示的上游引物TPS
‑4‑
F，核苷酸序列如SEQ ID NO.8所示的下游引物TPS
‑4‑
R。
[0007]在一种实施方式中，上述PCR扩增反应液体系包括DNA聚合酶、dNTP、MgSO4、荧光染料。
[0008]本专利技术提供的目的之二在于提供一种如上试剂盒的用途，用于制备筛查诊断阿尔兹海默病的试剂盒。
[0009]在一种实施方式中，筛查诊断阿尔兹海默病的试剂盒以人外周血细胞总RNA提取物为临床样本。
[0010]在一种实施方式中，上述试剂盒中TRPC6基因的PCR扩增引物组在临床样本诊断中检测准确度不低于85%，灵敏度不低于80%，特异性度不低于80%；进一步准确度不低于90%，特异性不低于80%，灵敏度不低于85%。
[0011]本专利技术提供的目的之三在于提供一种检测血液TRPC6 mRNA水平的方法。
[0012]其技术方案如下：一种检测血液TRPC6 mRNA水平的方法，使用如上任意一项所述的试剂盒，其关键在于步骤为：S1，提取RNA样本：取受试者血液，提取血液白细胞中总RNA；S2，PCR扩增检测：采用两个PCR扩增检测体系，使用一步法实时荧光定量PCR扩增法对RNA样本进行反转录扩增检测，分别获得RNA样本中TRPC6 mRNA的CT值和Actin mRNA的CT值；对系列梯度浓度的TRPC6目的基因校准品进行PCR扩增检测，得到不同浓度的TRPC6目的基因校准品CT值；对系列梯度浓度的Actin内参基因校准品进行PCR扩增检测，得到不同浓度的Actin内参基因校准品CT值；S3，数据处理：使用不同浓度的TRPC6目的基因校准品CT值及TRPC6目的基因校准品浓度，建立TRPC6目的基因CT值
‑
浓度数量关系；使用不同浓度的Actin内参基因校准品CT值及Actin内参基因校准品浓度，建立Actin内参基因CT值
‑
浓度数量关系；分别基于上述TRPC6目的基因和Actin内参基因CT值
‑
浓度数量关系，根据RNA样本中TRPC6 mRNA的CT值和Actin mRNA的CT值，计算RNA样本中TRPC6 mRNA浓度和Actin mRNA浓度；计算RNA样本中TRPC6 mRNA与Actin mRNA的浓度比值，作为检测结果。
[0013]在一种实施方式中，上述方法还包括步骤S4，将检测结果与设定阈值比较，当检测结果低于阈值时，判定为异常结果。
[0014]在一种实施方式中，上述步骤S3中，建立CT值
‑
浓度数量关系的方法为：使用不同浓度的TRPC6目的基因校准品CT值作为横坐标，TRPC6目的基因校准品浓度的2的对数值作为纵坐标，建立TRPC6目的基因CT值
‑
浓度标准曲线，计算标准曲线方程；使用不同浓度的Actin内参基因校准品CT值作为横坐标，Actin内参基因校准品浓
度的2的对数值作为纵坐标，建立Actin内参基因CT值
‑
浓度标准曲线，计算标准曲线方程。
[0015]在一种实施方式中，上述步骤S2中反转录扩增检测过程为：（1）配制反应体系，以反应总体系为20ul计，包括反应混合液10ul、反转录酶0.4ul、引物0.6ul（10uM）、9ul校准品、150ng模板RNA；（2）反转录条件为50℃保温5min，变性条件为94℃保温30s；（3）进行40个扩增循环反应，条件为：变性，94℃，5s；退火，61℃，15s；延伸，72℃，15s；（4）生成熔解曲线，升温过程为从65℃逐渐升温至95℃，速率为5s升温0.5℃。
[0016]本专利技术提本文档来自技高网...
【技术保护点】
【技术特征摘要】
1.一种检测TRPC6 mRNA水平的试剂盒，其特征在于：包括瞬时受体电位通道6 TRPC6基因的PCR扩增引物组、肌动蛋白Actin内参基因的PCR扩增引物组、TRPC6目的基因校准品、Actin内参基因校准品、PCR扩增反应液体系和反转录酶；所述TRPC6基因的PCR扩增引物组包括如下引物组中的至少一组：核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示的上游引物TPS
‑1‑
F，核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示的下游引物TPS
‑1‑
R；核苷酸序列如SEQ ID NO.5所示的上游引物TPS
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F，核苷酸序列如SEQ ID NO.6所示的下游引物TPS
‑3‑
R；核苷酸序列如SEQ ID NO.7所示的上游引物TPS
‑4‑
F，核苷酸序列如SEQ ID NO.8所示的下游引物TPS
‑4‑
R。2.根据权利要求1所述的检测TRPC6 mRNA水平的试剂盒，其特征在于：所述PCR扩增反应液体系包括DNA聚合酶、dNTP、MgSO4、荧光染料。3.如权利要求1或2所述的试剂盒在制备筛查诊断阿尔兹海默病的试剂盒中的应用。4.一种检测血液TRPC6 mRNA水平的方法，使用如权利要求1或2所述的试剂盒，其特征在于步骤为：S1，提取RNA样本：取受试者血液，提取血液白细胞中总RNA；S2，PCR扩增检测：采用两个PCR扩增检测体系，使用一步法实时荧光定量PCR扩增法对RNA样本进行反转录扩增检测，分别获得RNA样本中TRPC6 mRNA的CT值和Actin mRNA的CT值；对系列梯度浓度的TRPC6目的基因校准品进行PCR扩增检测，得到不同浓度的TRPC6目的基因校准品CT值；对系列梯度浓度的Actin内参基因校准品进行PCR扩增检测，得到不同浓度的Actin内参基因校准品CT值；S3，数据处理：使用不同浓度的TRPC6目的基因校准品CT值及TRPC6目的基因校准品浓度，建立TRPC6目的基因CT值
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浓度数量关系；使用不同浓度的Actin内参基因校准品CT值及Actin内参基因校准品浓度，建立Actin内参基因CT值
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浓度数量关系；分别基于上述TRPC6目的基因和Actin内参基因CT值
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浓度数量关系，根据RNA样本中TRPC6 mRNA的CT值和Actin mRNA的CT值，计算RNA样本中TRPC6 mRNA浓度和Actin mRNA浓度；计算RNA样本中TRPC6 mRNA与Actin mRN...
【专利技术属性】
技术研发人员：郑志强，闫锦锦，
申请(专利权)人：芜湖耄智生物科技有限公司，
类型：发明
国别省市：
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