一种生产星形孢菌素的基因工程菌及其制备方法技术

本发明专利技术公开了一种生产星形孢菌素的基因工程菌，所述高产星形孢菌素的基因工程菌为微白伦茨氏菌SIPI

【技术实现步骤摘要】
一种生产星形孢菌素的基因工程菌及其制备方法


[0001]本专利技术涉及生物工程领域，具体涉及一种生产星形孢菌素的基因工程菌及其构建/制备方法与应用。

技术介绍

[0002]恶性肿瘤是严重威胁人类健康的疾病。肺癌、肝癌、上消化系统肿瘤及结直肠癌、男性前列腺癌、女性乳腺癌等依然是我国主要的恶性肿瘤。目前我国恶性肿瘤的5年相对生存率约为40.5％，与10年前相比提高了约10个百分点，但与发达国家还有很大差距。手术、放疗、化疗和分子靶向药物依然是治疗癌症的几大主要手段,因此,发现更高效的抗肿瘤药物是降低恶性肿瘤死亡率最有效的办法。米哚妥林(商品名Rydapt)，主要由星形孢菌素通过化学合成的方法获得，如图1所示；是2017年4月美国FDA批准诺华上市的一款与化疗疗法联合用于新确诊的FLT3阳性的急性髓性白血病(AML)的新药，也是25年来白血病治疗的首个重大突破。Rydapt作为一种口服多靶向激酶抑制剂,主要通过阻断几种促进细胞增长的酶而起作用，其中包括FLT3，因此被开发用于携带FLT3突变的AML患者的治疗。
[0003][0004]图1米哚妥林的合成过程
[0005]星形孢菌素是米哚妥林的合成前体，分子式是C
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H
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N4O3，米哚妥林是一种抗肿瘤药物，目前，大规模微生物发酵法是生产星形孢菌素的主要方式，但是产量低、生产成本高的问题，这可能是米哚妥林目前价格居高不下的原因之一。
[0006]现有技术中，专利CN101397540B公布的星形孢菌素生产方法虽然能够一定程度提升星形孢菌素的产量，但星形孢菌素产量仍然较低，因此，通过构建新的生产星形孢菌素发酵菌株，从而提高星形孢菌素产量，降低生产成本，简化操作步骤，降低环境污染，提高收率，满足工业化生产的要求。

技术实现思路

[0007]本专利技术要解决的技术问题是克服现有技术中上述星形孢菌素发酵过程中产量较低的问题，提供一种生产星形孢菌素的高产基因工程菌及其构建方法和应用，可以利用基因工程技术提高生产星形孢菌素的效率，降低成本。
[0008]随着分子生物学技术的发展,利用工程手段能够定向改造或修饰抗生素生物合成基因簇，获得新型抗生素或提高抗生素产量。然而，本专利技术的难点在于星形孢菌素目标产物在其生产菌中的基因调控机理尚未清楚。本专利技术通过诸多研究和试验，发现将调控基因StaR导入产星形孢菌素的宿主菌,使之过表达，获得的工程菌产物中星形孢菌素的含量提高。
[0009]因此,本专利技术的技术方案之一是:一种生产星形孢菌素的基因工程菌，其特征在于，在生产星形孢菌素的出发菌株微白伦茨氏菌(Lentzea albida)的基因组中整合了调控基因StaR及启动子ermE*p或kasO*p。
[0010]优选的，所述调控基因StaR来源于自身基因，所述启动子ermE*p或kasO*p来源于人工合成的外源基因片段。
[0011]优选的，所述的调控基因StaR的核苷酸序列如SEQ ID No.l所示，启动子ermE*p的核苷酸序列如SEQ ID No.2所示，启动子kasO*p的核苷酸序列如SEQ ID No.3所示。
[0012]本专利技术所述的基因工程菌为微白伦茨氏菌SIPI
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ST
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H
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23(Lentzea albida)，保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCC No.27109，保藏日期是2023年4月13日。
[0013]本专利技术的再一技术方案是：一种本专利技术上述基因工程菌的制备方法，所述制备方法包括下列步骤：
[0014]1)PCR人工合成启动子ermE*p和kasO*p的全基因；
[0015]2)PCR扩增或人工合成StaR的全基因；
[0016]3)构建含StaR片段的同源重组pSET152
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StaR质粒，并转入大肠杆菌ET12567中；
[0017]4)构建不同启动子ermE*p和kasO*p的调控基因StaR重组pSET152
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StaR
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ermE*p和pSET152
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StaR
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kasO*p质粒；
[0018]5)将构建的重组质粒电转化到宿主菌SIPI
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ST
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07；
[0019]6)将带有重组质粒的新宿主菌和生产的星形孢菌素出发菌进行电转化，培养；
[0020]所述质粒pSET152
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StaR的核苷酸序列如SEQ ID No.4所示，质粒pSET152
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StaR
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ermE*p的核苷酸序列如SEQ ID No.5所示，质粒pSET152
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StaR
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kasO*p的核苷酸序列如SEQ ID No.6所示。
[0021]较佳地，所述重组质粒的骨架pSET152质粒：优选地，所述的中间宿主菌为大肠杆菌ET12567；优选地，所述的电转化培养为在ISP2琼脂培养基培养，温度为28℃。
[0022]本专利技术的另一技术方案是：一种星形孢菌素的制备方法，包括将上述任一种基因工程菌发酵，从发酵液中获得星形孢菌素。培养发酵方法可以选用现有星形孢菌素生产菌、特别是微白伦茨氏菌的培养发酵方法。
[0023]在符合本领域常识的基础上，上述各优选条件，可任意组合，即得本专利技术各较佳实例。本专利技术所用试剂和原料均市售可得。
[0024]本专利技术的积极进步效果在于：本专利技术通在星形孢菌素的生产菌微白伦茨氏菌中采用不同启动子ermE*p和kasO*p启动调控基因StaR，可以提高星形孢菌素产量，提高了生产效率，降低生产成本，减少环境污染。
附图说明
[0025]图1：pSET152
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StaR
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ermE*p质粒图谱；
[0026]图2：pSET152
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StaR
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kasO*p质粒图谱；
[0027]图3：SIPI
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ST
‑
H
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23菌株发酵产物HPLC图谱。
具体实施方式
[0028]下面通过实施例的方式进一步说明本专利技术，但并不因此将本专利技术限制在所述的实施例范围之中。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，按照常规方法和条件，或按照商品说明书选择。
[0029]微白伦茨氏菌(Lentzea albida)菌株SIPI
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ST
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07来自本实验室诱变得到产星形孢菌素的高产菌。
[0030]pSET152
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SARP和pSBI153质粒来自中国科学院植物生理生态研究所。
[0031]葡萄糖购自国药集团化学试剂有限公司，黄豆饼粉购自青岛科瑞生物技术有限公司，玉米浆干粉购自山东西王糖业有限公司，本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种生产星形孢菌素的基因工程菌，其特征在于，在生产星形孢菌素的出发菌株微白伦茨氏菌(Lentzea albida)的基因组中整合了调控基因StaR及启动子ermE*p或kasO*p。2.如权利要求1所述的基因工程菌，其特征在于，在生产星形孢菌素的出发菌株微白伦茨氏菌(Lentzea albida)的基因组中整合了调控基因StaR及启动子kasO*p。3.如权利要求1所述的基因工程菌，其特征在于，所述调控基因StaR来源于自身基因，所述启动子ermE*p或kasO*p来源于人工合成的外源基因片段。4.如权利要求1所述的基因工程菌，其特征在于，所述的调控基因StaR的核苷酸序列如SEQ ID No.l所示，启动子ermE*p的核苷酸序列如SEQ ID No.2所示，启动子kasO*p的核苷酸序列如SEQ ID No.3所示。5.如权利要求1所述的基因工程菌，其特征在于，基因工程菌为微白伦茨氏菌SIPI
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ST
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H
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23(Lentzea albida)，保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCC No.27109。6.一种如权利要求1
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5任一项所述基因工程菌的制备方法，其特征在于，所述制备方法包括下列步骤:1)PCR人工合成启动子ermE*p和kasO*p的全基因；2)PCR扩增或人工合成StaR的全基因；3)构建含StaR片段的同...

【专利技术属性】
技术研发人员：黄浩龙，胡海峰，张梦莹，夏瑜泽，刘佳乐，
申请(专利权)人：国药集团健康产业研究院有限公司，
类型：发明
国别省市：