幼畜卵母细胞体外两次受精方法技术

本发明专利技术提供的幼畜卵母细胞体外两次受精方法，受体均为４５－１００日龄母幼畜，经ＦＳＨ超数排卵处理，取卵母细胞１００枚／只以上待用；将体外成熟２５－２６小时的卵母细胞与精子混合，完成一次体外受精；５－６小时进行二次体外受精，过１３－１４小时，移于培养板培养，４８小时后统计卵裂率即可。成熟的卵母细胞需用０．１％的透明质酸酶处理３０－６０ｓ，经吹吸脱去部分卵丘细胞，加入２－５小时平衡好的５０－７０μｌ／滴的受精液内孵育；水浴解冻精液，放入ＣＯ２箱，２０－２５分钟，取上清液离心２－５分钟，沉淀的精子按２－４×１０６个／ｍｌ的密度加入受精液孵育；将受精５－６小时的卵取出，放入受精液中；用同前的方法解冻精子，加入受精液，经１３－１４小时，洗涤，移入平衡好的５００μｌ／孔的四孔培养板内培养。该方法简单易行，能使牛、羊的幼畜受精率达到８０－９２％，囊胚率达到４０－５０％。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及幼畜体外受精，尤其是用于卵母细胞的体外受精方法，采用有效的两 次受精，可提高受精率及胚胎发育率。
技术介绍
体外受精拟指在体外环境下完成精卵结合的过程。JIVET(juvenile invitro embryo transfer)即幼畜早期辅助繁殖技术，是集诱导幼畜卵泡发育技术，体外受精，胚胎 移植等技术为一体的胚胎生物技术体系；其主要技术环节包括幼畜超排，卵母细胞采集，体 外成熟培养，体外受精，早期胚胎体外发育，胚胎移植等，体外受精是其关键步骤之一。传统 的成年动物卵母细胞体外受精技术是将体外成熟26小时的卵母细胞进行一次受精，即可 获得理想的结果。文献检索由广东省农业科学院兽医研究所王祖昆等4人完成的《影响猪 卵母细胞体外成熟受精和发育因素的研究》研究成果，首次提出了两次体外受精法的新理 论和新方法，主要是针对猪卵子体外受精中成熟不同步，一次受精难以满足大多数卵子适 时受精的需要，采用两次体外受精法，可以满足大部分卵子的受精需求；结果是卵裂率显著 高于一次或三次受精法的卵裂率，显著提高卵子的体外受精率。由此表明，国内有关猪卵细 胞体外两次受精的研究已见文献报道，但有关幼畜卵细胞体外两次受精的报道较少。本发 明以此为切入点，展开的实验研究方法具有科学性与实践性。
技术实现思路
本专利技术的目的在于提供用于，目的是提高受精 率及胚胎发育率。本专利技术的目的是这样实现的，受体均为45-100 日龄母幼畜，经FSH-PMSG超数排卵处理后，手术抽取卵母细胞100枚/只以上待用；将体外 成熟25-26小时的卵母细胞与精子混合，完成一次体外受精；5-6小时进行二次体外受精， 再经13-14小时，入培养板；最佳效果是将体外成熟25小时的卵母细胞与精子混合，完成 一次体外受精；5小时进行二次体外受精，再经13小时；入培养板内培养，48小时后统计卵 裂率即可；其中，将卵母细胞用成熟液洗涤3-4遍，按25-30枚/滴的密度加入经3_5小时平 衡，体积为75-100 μ 1/滴的成熟液中，入CO2箱，在5% C02、95%的空气条件下培养；其中，将成熟卵母细胞，用0. 的透明质酸酶处理30-60s，经吹吸，脱去部分 卵丘细胞，用受精液洗涤2-4遍，按25-30枚/滴的密度加入经2-5小时平衡，体积为 50-70 μ 1/滴的受精液中；水浴解冻精液，移入经2-3小时平衡，含受精液的试管中，放入 CO2箱，上游20-25分钟后，取上清液以1500转/分钟的转速离心2_5分钟，将沉淀的精子 按2-4 X IO6个/ml的密度加入受精液，与卵母细胞共同孵育；其中，将受精5-6小时的卵取出，采用平衡好的受精液洗涤2-3遍，放入备用的受 精液中；用同前的方法解冻精子，再按2-4X106个/ml的密度加入受精液，过13-14小时，将受精卵移至平衡好的培养液内，经吹吸，脱去全部卵丘细胞及黏附卵上的精子，洗涤3-4 遍，按50-70枚/孔的密度移入平衡好的500 μ 1/孔的四孔培养板内培养。所述的体外两次受精方法，使用药剂的配制抽卵液TCM199-h印es+lmg/mlPVA+0. 7mg/ml 肝素钠；成熟液TCM199-HC03+10% FBS+0. 05IU/ml FSH+0. 05IU/ml LH+1 μ g/ml 雌二醇 +24. 2mg/L 丙酮酸钠 +0. ImM/L 半胱氨酸 +10ng/ml EGF+100IU/ml 双抗；SOF 由 6. 29mg/ml NaCL+0. 534mg/mlKCL+0. 162mg/mlKH2P04+0. 6 μ 1/ml 乳酸钠 +0. 089mg/ml MgS04+2. lmg/mlNaHC03+0 . 0 3 5 7mg/ml 丙酮酸钠 +0. 299mg/mlCaCL2 · 2H20 组成受精液S0F+20%发情羊血清+6IU/ml肝素钠+2. 5IU/ml庆大霉素；培养液S0F+3mg/mlBSA。所述的体外两次受精方法，取卵巢表面的卵泡时，选用18-20G针头，在吸入抽卵 液2-3ml时，即可抽取。所述的体外两次受精方法，采用两次体外受精，受精率达80-92%，囊胚率达到 40-50%。所述的体外两次受精方法，选用的幼畜，绵羊、山羊、杂交羊为40-70日龄；黄牛、 水牛、奶牛为80-100日龄。所述的体外两次受精方法，选用的实验材料除羊血清自制外，其他均为市售产品。本专利技术的构思及研究机理传统的体外受精技术是一次即可，但由于幼畜早期辅助繁殖技术(JIVET)中所获 得的卵母细胞来源于尚未成熟的幼畜卵巢，经过体外成熟培养后发育同步性差，体外成熟 25小时后只有近一半的卵母细胞达到细胞核成熟，体外成熟30小时后，虽然成熟的比例上 升，但早期成熟的卵母细胞退化的比例也在上升；若此时受精，受精率低；若后期受精，受 精率虽高，但退化率高，后期发育率(囊胚率)低；采用间隔5-6小时两次受精，受精率、囊 胚率都会大幅度的提高。其研究机理是早成熟的卵母细胞在第一次与精子混合的时候就可 以完成受精，受精后通过透明带反应，阻止多精子入卵，所以在第二次与精子混合后已经受 精的卵不会再参与受精；未成熟的卵母细胞仍在继续成熟，体外成熟培养30小时后，未受 精的卵母细胞基本成熟，在第二次与精子混合13小时后即可完成受精。本专利技术统计30小时后卵裂率；统计7天后囊胚率；结果见表。表组别_卵裂率(％)_嚢胚率(% )成熟25小时一次受精50.230.77成熟30小时一次受精72.3310两次受精_80. 0-92. O_40. 0-50. O本专利技术构思的技术效果取卵选择45-100日龄幼畜为宜，日龄大，超排效果不好。抽吸突出卵巢表面的卵泡，选用18-20G针头，针头大回收率低，针头小颗粒细胞易脱落可用率降低。 将显微镜下回收的卵母细胞，经成熟液洗涤，加入培养液，入CO2箱在5% C02,95% 的空气条件下培养，能促进细胞生长。精液采用1500转/分钟的转速离心2-5分钟，可避免转速大、时间长，影响精子活 力；转速小，时间短，离出的精子少的弊端。精子按2-4X IO6个/ml的密度加入受精液，可避免密度低，影响受精率；密度太 大，增加多精受精率，后期发育率低的弊端。受精的卵母细胞需采用0. 的透明质酸酶处理30-60s，可避免时间长，影响后 期发育，时间短，脱颗粒细胞效果不好的弊端。受精卵移至平衡好的培养液内时，需脱去全部卵丘细胞及黏附卵上的精子，避免 影响后期发育。本专利技术以提高幼畜的受精率及胚胎发育率为突破口，通过精心设计与方法实践， 采用间隔5-6小时体外两次受精方法，受精率可达到80-92 %，囊胚率达到40-50 %，效果极 佳，尤其适宜羊、牛的母幼畜，为畜牧业的种群发展提供了科学依据，彰显技术进步。具体实施例方式下面将结合实施例就专利技术作进一步的说明。的实 施方案如下。实施例受精步骤选择50日龄羔羊或90日龄牛犊，在第1-3天共实施6次FSH间隔12 小时肌肉注射超数排卵，第4天，手术方法抽取卵母细胞的卵子100枚/只以上，在体外成 熟26小时后与精子混合，完成一次体外受精；6小时后进行二次体外受精，14小时后，移入 培养板中培养，48小时后统计卵裂率即可。最佳效果是将体外成熟25小时本文档来自技高网...

【技术保护点】
幼畜卵母细胞体外两次受精方法，其特征在于：受体均为４５－１００日龄母幼畜，经ＦＳＨ－ＰＭＳＧ超数排卵处理后，手术抽取卵母细胞１００枚／只以上待用；将体外成熟２５－２６小时的卵母细胞与精子混合，完成一次体外受精；５－６小时进行二次体外受精，再经１３－１４小时，入培养板；最佳效果是：将体外成熟２５小时的卵母细胞与精子混合，完成一次体外受精；５小时进行二次体外受精，再经１３小时，入培养板内培养，４８小时后统计卵裂率即可；其中，将卵母细胞用成熟液洗涤３－４遍，按２５－３０枚／滴的密度加入经３－５小时平衡，体积为７５－１００μｌ／滴的成熟液中，入ＣＯ↓［２］箱，在５％ＣＯ↓［２］、９５％的空气条件下培养；其中，将成熟卵母细胞，用０．１％的透明质酸酶处理３０－６０ｓ，经吹吸，脱去部分卵丘细胞，用受精液洗涤２－４遍，按２５－３０枚／滴的密度加入经２－５小时平衡，体积为５０－７０μｌ／滴的受精液中；水浴解冻精液，移入经２－３小时平衡，含受精液的试管中，放入ＣＯ↓［２］箱，上游２０－２５分钟后，取上清液以１５００转／分钟的转速离心２－５分钟，将沉淀的精子按２－４×１０↑［６］个／ｍｌ的密度加入受精液，与卵母细胞共同孵育；其中，将受精５－６小时的卵取出，采用平衡好的受精液洗涤２－３遍，放入备用的受精液中；用同前的方法解冻精子，再按２－４×１０↑［６］个／ｍｌ的密度加入受精液，过１３－１４小时，将受精卵移至平衡好的培养液内，经吹吸，脱去全部卵丘细胞及黏附卵上的精子，洗涤３－４遍，按５０－７０枚／孔的密度移入平衡好的５００μｌ／孔的四孔培养板内培养。...

【技术特征摘要】

【专利技术属性】
技术研发人员：郭志勤，汪立芹，杨梅，吴伟伟，陈童，
申请(专利权)人：新疆维吾尔自治区畜牧科学院中国澳大利亚绵羊育种研究中心，
类型：发明
国别省市：65[中国|新疆]