一种鹰嘴豆中原生抗菌多肽的快速制备方法技术

本发明专利技术涉及一种鹰嘴豆中原生抗菌多肽的快速制备方法，该方法通过磷酸缓冲溶液提取、硫酸氨沉淀、以及超滤膜等步骤纯化得到分子量８．５ＫＤ的具有抗菌活性的多肽，为维吾尔药食两用植物鹰嘴豆的生物活性物质基础研究，并开发相应的产品提供了依据。该方法提取、分离过程简单，又不易使多肽失活，制备的多肽抗菌活性高，无毒性、热稳定性好，易于扩大规模生产，降低纯化过程成本，是制备生物活性多肽的理想方法之一。通过该方法获得的多肽作为制备食品、药品添加剂的用途。

【技术实现步骤摘要】
鹰嘴豆(Cicer arietin腦l/L L.)属于豆科，豌豆族，鹰嘴豆 属，在新疆有2500年的生长历史，是维吾尔医常用药材，维吾尔语 名为诺胡提，已被收载在中华人民共和国卫生部《药品标准》维吾尔 药分册和《维吾尔药志》中，"它具有清除异常体液，开通体液闭阻， 调节机体等作用。用于身体瘦弱，性欲低下，食欲不振，皮肤瘙痒及 糖尿病等疾病"。虽然鹰嘴豆用药历史悠久，但其功能因子不清楚， 特别是具有生物活性多肽类化合物的研究空白；生物体内广泛存在一种具有抗菌作用的活性多肽，被称为抗菌 肽，由于最早被发现的是其抗细菌功能，因而被命名为抗菌肽 (antibacterial p印tides， AM0L/LPs)。它是生物非特异性防御系统 的免疫应答产物，是生物体抵御外源性病原微生物的入侵而产生的一 类小分子多肽，具有广谱抗菌活性，不仅可以抑制多种细菌或真菌， 甚至可以在不伤及正常细胞的情况下抑制动物体内的肿瘤细胞。因 此，抗菌肽的研究已成为基因工程、药物开发等领域的研究热点，具 有着极为广阔的市场应用前景。与传统的抗生素相比，抗菌肽具有分子量小、抗菌谱广、热稳定 性好、抗菌机理独特等优点。抗菌肽一般含有10 100个氨基酸残基， 成熟的抗菌肽来源于前体蛋白的水解，大多数抗菌多肽由于富含碱性 氨基酸而带正电荷。植物抗菌肽虽然是一类小分子蛋白质，但其结构与组成复杂多样。 根据植物抗菌肽的氨基酸序列及二级结构，并已发表的植物抗菌肽有 以下9类植物抗菌肽的氨基酸序列同源性不是很高，但存在一些共 同特征，绝大多数的植物抗菌肽富含半胱氨酸(Cys)，而且所有的Cys都形成分子内二硫键，这可能是植物抗菌肽对热非常稳定的原 因。二硫键的数量与植物抗菌肽的分类无直接关系，甚至在同一类型 中就有变化。同一类型植物抗菌肽的二硫键一般都有典型的连接方式 及相似三维空间构型。迄今分离的大多数植物抗菌肽都有广谱抗真菌或细菌的特性外， 还发现环肽kalataBl具有抑制棉铃虫等昆虫的生长和发育的功能， circulins A和B具有抗艾滋病毒HIV的功能，而一些植物防御素对 a淀粉酶的活性有抑制能力。传统抗生素是通过消除微生物生长或生存必需的功能，如阻挠细 菌蛋白质的合成或者改变酶的活性来达到杀菌的目的，而细菌通过改 变一种基因就足以对付抗生素的这种进攻。抗菌肽则作用于细菌细胞 膜，导致膜的通透性增大，以此穿透、杀灭细菌。细菌必须改变膜的 结构，即改变相当部分的基因才能防御抗菌肽的进攻，而这几乎是不 可能的。因此,抗菌肽极大地减少了微生物或细菌产生耐药性的可能。 而且抗菌肽只对原核生物细胞和真核生物病变细胞有抗菌作用，对正 常的真核生物细胞不起作用。原因在于原核生物和真核生物的细胞膜 结构不同，真核细胞膜中含有大量的胆固醇，而胆固醇的存在使膜结构趋于稳定。此外高等动物存在高度发达的细胞骨架系统，其存在也 .抵抗了抗菌肽的作用。癌细胞的细胞骨架系统与正常细胞相比不发 达，这是抗菌肽对其产生抑制作用的原因之一。目前，抗菌肽在农业、医药、食品和化妆品等领域已经有了一定 的应用实践并取得了较好的效果。在农业领域，抗菌肽成分为易消化 吸收的氨基酸，可作为畜禽词料添加剂取代或部分取代目前饲喂动物 所用的抗生素，减少抗生素对动物体的危害。另有研究表明，抗菌肽 对流感病毒、疱疹病毒、乙型肝炎病毒等也有抑制作用。有报道，一 些抗菌肽在亚毒性浓度下可抑制艾滋病毒HIV-1的基因表达。抗菌肽 能特异性抑制某些肿瘤的生长，对人体正常细胞无害，极有可能成为和化妆品领域，如从乳酸菌中分离 的抗菌肽细菌素，可抑制食品中的各种病原微生物的生长而作保藏 剂。抗菌肽在化妆品上用作防腐剂，鱼类抗菌肽不仅是营养成分，更 重要的是它的抗菌和美容作用，比化学防腐剂用于化妆品具有独特的 优势和广泛的市场潜力。由于抗菌肽的分子小，所以直接从动植物组织中提取天然抗菌 肽时，天然提取资源有限，工艺复杂，成本昂贵，故化学合成和基因 工程法成为获得抗菌肽的主要手段。但是化学合成抗菌肽成本高，而 通过基因工程在微生物中直接表达抗菌肽基因，由于抗菌肽分子小， 易被蛋白酶降解，而且表达产物可能对宿主有害，从而影响了基因的 高水平表达。如何提高生产效率、降低成本成为抗菌肽基因工程研究 亟待解决的问题。在国内植物多肽类化合物的研究尚处于初始阶段， 研究范围小，研究主要集中在药理、基因表达和综述等方面，对于多 肽类化合物的化学研究文献很有P艮，而且使用的方法中植物多肽类化 合物回收低，不适用于大规模制备，这很大程度上限制了多肽类活性 化合物的应用和工业化生产。因此，寻找安全高效的抗生素替代品就 显得十分重要。本专利技术的目的在于提供一种鹰嘴豆中原生抗菌多肽的快速制备 方法，该方法通过磷酸缓冲溶液提取、硫酸氨沉淀、以及超滤膜等步骤纯化得到分子量8. 5KDa的具有抗菌活性的多肽，为维吾尔药食两 用植物鹰嘴豆的生物活性物质基础研究，并开发相应的产品提供了依 据。该方法提取、分离过程简单，又不易使多肽失活，制备的多肽抗 菌活性高，无毒性、热稳定性好，易于扩大规模生产，降低纯化过程 成本，是制备生物活性多肽的理想方法之一。通过该方法获得的多肽 作为制备食品、药品添加剂的用途。本专利技术所述的，按下 列步骤进行a、 将脱脂鹰嘴豆用液氮冰冻，机械粉碎，过筛10-100目，再用 磷酸缓冲液在温度4"C搅拌提取，时间为1-8小时，过滤，将滤液用 低温离心机除去沉淀，得到上清液备用；b、 将上清液加入无水硫酸氨，充分搅拌溶解后放置冰箱静置24 小时，离心，沉淀，将沉淀物采用透析脱盐后，干燥得到粗提多肽， 上清液可以用来提取其它的有用多肽；c、 将步骤b粗提多肽用重蒸水溶解，用超滤膜过滤，多肽经超 滤膜过滤后分为两部分，下层为小分子量多肽，上层为大分子量多肽， 将两部分分别低温干燥得到不同分子量范围的多肽，收集下层小分子 抗菌多肽；d、 再利用常规方法SDS-PMG确定提取的多肽的分子量，并利用 银染色确认所提取分离的多肽纯度，以及对所提取分离的多肽作金黄 色葡萄糖球菌的抑制作用来确定其抗菌活性。步骤a、 b和c中的提取、分离、纯化过程所用水均为三蒸水。步骤a、 b和d中的低温离心速度为12000转/分。步骤a中磷酸盐缓冲溶液的浓度为0. 01-0. lmol/L,pH=6. 0-8. 0。步骤b中无水硫酸铵饱和度为30%-80%。步骤c中的超滤膜为3-30KD。所述的方法获得的鹰嘴豆抗菌多肽作为制备食品或药品的添加 剂的用途。附图说明图l为本专利技术抗菌活性筛选图，其中A:标准样品4:超滤纯化 多肽样品。图2为本专利技术SDS-PMG凝胶电泳-银染色图，其中1为标准蛋 白标记，2为超滤纯化样品。具体实施例方式实施例1多肽的提取取100克脱脂的鹰嘴豆用液氮冰冻鹰嘴豆细胞，并机械粉碎，过 筛10目，再用磷酸缓冲液(0.1mol/L， pH=6.0)在温度4-C搅拌提 取1小时，将提取液先用纱布过滤，滤液用低温离心机除去沉淀，得 到上清液备用； 多肽的分离将上清液根据体积添加无水硫酸氨至其饱和度为30%，充分搅拌 溶解后放入于冰箱中静置24小时，离心，沉淀，将沉淀物采用透析 脱盐后，干燥得到粗提多肽，上清液可以用来提取其它的有用本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种鹰嘴豆中原生抗菌多肽的快速制备方法，其特征在于按下列步骤进行：　ａ、将脱脂鹰嘴豆用液氮冰冻，机械粉碎，过筛１０－１００目，再用磷酸缓冲液在温度４℃搅拌提取，时间为１－８小时，过滤，将滤液用低温离心机除去沉淀，得到上清液备用；　 　ｂ、将上清液加入无水硫酸氨，充分搅拌溶解后放置冰箱静置２４小时，离心，沉淀，将沉淀物采用透析脱盐后，干燥得到粗提多肽，上清液可以用来提取其它的有用多肽；　ｃ、将步骤ｂ粗提多肽用重蒸水溶解，用超滤膜过滤，多肽经超滤膜过滤后分为两部分， 下层为小分子量多肽，上层为大分子量多肽，将两部分分别低温干燥得到不同分子量范围的多肽，收集下层小分子抗菌多肽；　ｄ、再利用常规方法ＳＤＳ－ＰＡＡＧ确定提取的多肽的分子量，并利用银染色确认所提取分离的多肽纯度，以及对所提取分离的多肽作金 黄色葡萄糖球菌的抑制作用来确定其抗菌活性。

【技术特征摘要】

【专利技术属性】
技术研发人员：阿布力米提伊力，马庆苓，阿吉艾克拜尔艾萨，
申请(专利权)人：中国科学院新疆理化技术研究所，
类型：发明
国别省市：65[中国|新疆]