磁珠法B族链球菌DNA提取试剂盒和提取方法技术

本发明专利技术属于分子微生物学领域，具体涉及磁珠法B族链球菌DNA提取试剂盒和提取方法。该磁珠法B族链球菌DNA提取试剂盒，包括菌清洗液、菌结合液、捕获微球溶液、裂解液、清洗液1、清洗液2和洗脱液。Gauge提取试剂盒中的清洗液和结合液配合，使得菌体暴露出抗体的结合位点与捕获微球结合，不经过离心等操作即可实现菌体的全部收集，增大了样本体积加入量。增大了样本体积加入量。增大了样本体积加入量。

【技术实现步骤摘要】
磁珠法B族链球菌DNA提取试剂盒和提取方法


[0001]本专利技术属于分子微生物学领域，具体涉及磁珠法B族链球菌DNA提取试剂盒和提取方法。

技术介绍

[0002]DNA提取是分子生物学研究的一个重要环节，是几乎所有核酸检测的基础。传统的B族链球菌DNA提取方法有物理破碎法、煮沸法、酚
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氯仿抽提法、盐析法等。但是上述方法均存在一些缺点：(1)传统的提取方法需要反复的换管或离心、分液等操作，步骤繁琐，工作效率低，容易导致交叉污染，且自动化难以实现。(2)酚
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氯仿抽提法需要使用有毒物质，对人体有害且易污染环境。(3)采用盐析法和煮沸法提取的DNA纯度低。(4)物理破碎法操作较为繁琐，提取的DNA纯度低且完整性差。
[0003]近几年，随着磁珠法提取试剂的推广，也有使用磁珠法提取B族链球菌DNA的试剂盒上市，且逐步成为目前检验机构用来处理和提取B族链球菌DNA的主要方法。但是现有的试剂盒存在以下缺陷：(1)需使用蛋白酶K或者溶菌酶或特定细菌裂解酶等酶组分，且所检测的样本量由于自动化设备配套耗材容积及试剂本身的限制，样本量仅为0～300μL，若要处理更大体积，仍需离心等繁琐的操作，在B族链球菌DNA提取上，仅实现了一定程序上的自动化。(2)现有的磁珠法提取B族链球菌DNA的试剂盒所能处理的样本量仅为0～300μL，对于B族链球菌这一容易呈链状分布的样本，成链状态有短有长，其菌液为非均一分布，导致现有磁珠法提取试剂单个样本的重复性较差。(3)虽然部分试剂使用双孔裂解，如公布号为CN111334502A的中国专利技术专利公开了一种快速提取B族链球菌核酸的方法，通过双孔裂解，使得样本量数量不仅仅局限于250μL，有利于获得更多的核酸，但仍然无法避免由于B族链球菌链状分布导致取样差异，从而造成无效取样。

技术实现思路

[0004]为了克服上述现有技术的缺陷，本专利技术所要解决的技术问题是提供一种操作简单，且样本加入量大的磁珠法B族链球菌DNA提取试剂盒和提取方法。
[0005]为了解决上述技术问题，本专利技术采用的技术方案为：磁珠法B族链球菌DNA提取试剂盒，包括菌清洗液、菌结合液、捕获微球溶液、裂解液、清洗液1、清洗液2和洗脱液；所述菌清洗液为0.1～2M的亚硝酸钠溶液；所述菌结合液包括1～3M乙酸和5～10M乙酸钠。
[0006]本专利技术采用的另一技术方案为：磁珠法B族链球菌DNA提取试剂盒的提取方法，包括以下步骤：使用菌清洗液将菌从采集工具上清洗下来，得到菌液，菌液经过手动或自动完成DNA提取；
[0007]所述手动完成DNA提取包括以下步骤：
[0008]S1：将菌液加入菌结合液，混匀后加入捕获微球溶液，再次混匀置于35～39℃下温浴8～12min，再磁吸1.5～2.5min后去除液体；
[0009]S2：加入裂解液，在63～67℃、1450～1550rpm的条件下裂解10min，随后磁吸2.5～
3.5min后去除液体；
[0010]S3：加入清洗液1，震荡混匀后磁吸1.5～2.5min后去除液体；再加入清洗液2，震荡混匀后磁吸1.5～2.5min后去除液体；
[0011]S4：静置1.5～2.5min，加入洗脱液在63～67℃、1450～1550rpm的条件下洗脱，再磁吸2.4～3.5min，完成DNA提取。
[0012]本专利技术的有益效果在于：本专利技术的DNA提取试剂盒中清洗液和结合液配合，使得菌体暴露出抗体的结合位点与捕获微球结合，不经过离心等操作即可实现菌体的全部收集，可避免B族链球菌链状分布，增大了样本体积加入量。
[0013]本专利技术的DNA提取方法，先使用菌清洗液提供水环境及盐离子浓度，以将B族链球菌从干拭子上清洗下来，形成菌液；再结合液中的组分与清洗液组分混合，使得悬浮在清洗液中的菌体暴露出抗体结合位点，与标记在磁性微球表面的抗体结合，形成B族链球菌
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磁珠复合体，并在磁场的作用下，将B族链球菌
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磁珠复合体与溶液分开，实现菌体富集；然后使用含有高浓度离序盐和表面活性剂的裂解液，以裂解和释放核酸；最后经过清洗和洗脱后，完成DNA提取。
附图说明
[0014]图1所示采用本专利技术实施例4的提取方法提取DNA后检测得到的荧光PCR扩增曲线图；
[0015]图2所示采用本专利技术实施例4的提取方法提取DNA后检测得到的标准曲线图。
具体实施方式
[0016]为详细说明本专利技术的
技术实现思路
、所实现目的及效果，以下结合实施方式并配合附图予以说明。
[0017]本专利技术最关键的构思在于：清洗液和结合液配合，使得菌体暴露出抗体的结合位点与捕获微球结合，不经过离心等操作即可实现菌体的全部收集，增大了样本体积加入量。
[0018]请参照图1至图2所示，本专利技术的磁珠法B族链球菌DNA提取试剂盒，包括菌清洗液、菌结合液、捕获微球溶液、裂解液、清洗液1、清洗液2和洗脱液；菌清洗液为0.1～2M的亚硝酸钠溶液；菌结合液包括1～3M乙酸和5～10M乙酸钠。
[0019]从上述描述可知，本专利技术的有益效果在于：清洗液和结合液配合，使得菌体暴露出抗体的结合位点与捕获微球结合，从而不经过离心等操作即可实现菌体的全部收集。可避免B族链球菌链状分布，解决了现有磁珠法对样本体积加入量的限制。
[0020]菌清洗液提供了水环境及盐离子浓度，以将B族链球菌从干拭子上清洗下来，形成菌悬液。
[0021]优选地，菌清洗液为0.5M的亚硝酸钠溶液，菌结合液包括1M乙酸和6M乙酸钠。
[0022]进一步地，捕获微球溶液包括磁珠，磁珠为单分散、超顺磁性的标记有羧基和硅羟基的纳米磁珠，且标记修饰有B族链球菌抗体；磁珠悬浮在乙醇溶液中。
[0023]进一步地，磁珠的粒径为200～800nm。
[0024]从上述描述可知，所用磁珠为单分散、超顺磁性的标记有羧基和硅羟基的纳米磁珠，并利用其表面的羧基基团，将B族链球菌抗体标记在磁珠上。磁珠表面的硅羟基用于后
续将所捕获到的菌体裂解后结合释放出来的DNA。结合液中的组分与清洗液组分混合后，会悬浮在清洗液中的菌体暴露出抗体结合位点，使之与标记在磁性微球表面的抗体结合，形成B族链球菌
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磁珠复合体，并在磁场的作用下，将B族链球菌
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磁珠复合体与溶液分开，实现菌体富集。
[0025]进一步地，裂解液包括异硫氰酸胍、十二烷基硫酸钠、聚乙二醇、异丙醇、三羟甲基氨基甲烷和无菌去离子水，裂解液的pH值为5.5～8.5。
[0026]进一步地，裂解液包括2～6mol/L的异硫氰酸胍、50～150mmol/L的三羟甲基氨基甲烷、质量百分比为0.1～1％的十二烷基硫酸钠、质量百分比为5～10％的聚乙二醇、质量百分比为10～40％的异丙醇以及余量的无菌去离子水。
[0027]从上述描述可知，该裂解液使用的为高浓度的异硫氰酸胍(离序盐)和十二烷基硫酸钠(表面活性剂)，本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.磁珠法B族链球菌DNA提取试剂盒，其特征在于，包括菌清洗液、菌结合液、捕获微球溶液、裂解液、清洗液1、清洗液2和洗脱液；所述菌清洗液为0.1～2M的亚硝酸钠溶液；所述菌结合液包括1～3M乙酸和5～10M乙酸钠。2.根据权利要求1所述的磁珠法B族链球菌DNA提取试剂盒，其特征在于，所述捕获微球溶液包括磁珠，所述磁珠为单分散、超顺磁性的标记有羧基和硅羟基的纳米磁珠，且标记修饰有B族链球菌抗体；所述磁珠悬浮在乙醇溶液中。3.根据权利要求1所述的磁珠法B族链球菌DNA提取试剂盒，其特征在于，所述裂解液包括异硫氰酸胍、十二烷基硫酸钠、聚乙二醇、异丙醇、三羟甲基氨基甲烷和无菌去离子水，所述裂解液的pH值为5.5～8.5。4.根据权利要求1所述的磁珠法B族链球菌DNA提取试剂盒，其特征在于，所述清洗液1包括盐酸胍、三羟甲基氨基甲烷、乙醇和无菌去离子水，所述清洗液1的pH值为5.5～7.5。5.根据权利要求1所述的磁珠法B族链球菌DNA提取试剂盒，其特征在于，所述清洗液2包括氯化钠、乙醇、三羟甲基氨基甲烷和无菌去离子水，所述清洗液2的pH值为6.5～8.5。6.根据权利要求1所述的磁珠法B族链球菌DNA提取试剂盒，其特...

【专利技术属性】
技术研发人员：黄海峰，石青，李晓燕，
申请(专利权)人：泰普生物科学中国有限公司，
类型：发明
国别省市：