一种间插Gibson组装的OE-PCR扩增方法技术

本发明专利技术属于基因工程技术领域，公开了一种间插Gibson组装的OE

【技术实现步骤摘要】
一种间插Gibson组装的OE
‑
PCR扩增方法


[0001]本专利技术属于基因工程
，涉及一种间插Gibson组装的OE
‑
PCR扩增方法。

技术介绍

[0002]目前，重叠延伸PCR(OverlapextensionPCR，OE
‑
PCR)是常用的分子生物学技术，多用于DNA片段融合与基因定点突变。一般做法是将具有重叠序列的两个DNA片段经变性
‑
退火后互补
‑
延伸形成融合DNA，再以之为模板指数扩增。也有三个或更多DNA片段同步进行的做法，可用于多片段融合与克隆基因多位点突变。科研工作者都有类似经历：短DNA片段OE
‑
PCR容易实现；长DNA片段OE
‑
PCR融合困难；多DNA片段一次性OE
‑
PCR融合成功的希望较小。遇到这类问题时可以尝试多种优化方案：如调整重叠序列长度，摸索退火温度，调整反应体系的缓冲液成分等。也可以两步法运行OE
‑
PCR程序，即先行无引物热循环以期两个DNA片段能充分重叠
‑
延伸，再进行有引物运行让融合DNA指数扩增。此外，某些纳米材料和核内小分子也可以起到PCR增效剂的作用。然而，上述处理的作用有限，因其中缺乏特定规律，往往反复调整反应条件亦不能达到预期的DNA片段融合扩增效果。科研工作者亟需一种稳定有效的OE
‑
PCR解决方案。
[0003]通过上述分析，现有技术存在的问题及缺陷为：针对长基因或多DNA片段的OE
‑
PCR成功率低，且缺乏稳定有效的解决方案。
[0004]Gibson组装最早由DanielG.Gibson及其同事于2009年提出，利用TaqDNA连接酶、T5核酸外切酶和PhusionDNA聚合酶的协同作用，在同一试管中、同一温度下对含有重叠末端序列的DNA片段进行快速拼接。分析OE
‑
PCR融合与Gibson组装过程，会发现两者各有优势。对于OE
‑
PCR融合困难的基因，利用Gibson组装将DNA片段先行拼接，再进行指数扩增是一种有效解决方案。

技术实现思路

[0005]针对现有技术存在的问题，本专利技术提供了一种间插Gibson组装的OE
‑
PCR扩增方法，该方法尤其在涉及长基因及多DNA片段OE
‑
PCR时优势较为显著。
[0006]本专利技术是这样实现的，在常规OE
‑
PCR较为困难的时候，如长基因及多DNA片段的OE
‑
PCR融合，在获取各基因片段后，将基因片段等比例混合进行Gibson组装，再直接以组装混合物作为模板进行第二轮PCR扩增；在前后两轮PCR之间插入一次Gibson组装过程，使得DNA片段在较为温和的条件下更容易形成融合基因模板，以便在第二轮PCR中指数扩增。
[0007]进一步，间插Gibson组装的OE
‑
PCR扩增方法包括以下步骤：
[0008]步骤一，进行引物设计与合成；；
[0009]步骤二，进行第一轮PCR扩增；
[0010]步骤三，将DNA片段进行Gibson组装；
[0011]步骤四，进行第二轮PCR扩增；
[0012]步骤五，进行DNA产物的鉴定与序列分析。
[0013]进一步，步骤一中，引物采用PrimerPremier5.0软件设计，经PAGE纯化。
[0014]进一步，步骤一中，引物S1的核苷酸序列为SEQ ID NO：1，引物S2的核苷酸序列为SEQ ID NO：2，引物S3的核苷酸序列为SEQ ID NO：3，引物S4的核苷酸序列为SEQ ID NO：4，引物S5的核苷酸序列为SEQ ID NO：5，引物S
b
的核苷酸序列为SEQ ID NO：6，引物S
b0
的核苷酸序列为SEQ ID NO：7，引物S
c
的核苷酸序列为SEQ ID NO：8，引物S
c0
的核苷酸序列为SEQ ID NO：9，引物S
RB
的核苷酸序列为SEQ ID NO：10，引物S
RB780
的核苷酸序列为SEQ ID NO：11，引物A
RB780
的核苷酸序列为SEQ ID NO：12，引物S
RB1295H
的核苷酸序列为SEQ ID NO：13，引物S
RB1786X
的核苷酸序列为SEQ ID NO：14，引物A
RB1295H
的核苷酸序列为SEQ ID NO：15，引物A
RB1786X
的核苷酸序列为SEQIDNO：16，引物A
RB
的核苷酸序列为SEQ ID NO：17，引物A
C3
的核苷酸序列为SEQ ID NO：18。
[0015]进一步，步骤二中的DNA扩增包括：
[0016]第一轮PCR：取pEGFP_C1
‑
RB质粒1ng稀释到9.6μLddH2O中，加入上、下游引物各0.2μL，加入10μL2
×
PCRTaqMix。PCR产物经电泳检测后切取目标条带回收至30μLddH2O中，并分别进行双片段组装和三片段组装；以等量ddH2O替代2
×
AssemblyMix作负对照，50℃孵育1h，而后94℃5min使酶失活。
[0017]第二轮PCR：取0.5μL组装物或正、负对照，加入10μL2
×
PCRTaqMix，上下游引物各0.2μL；根据预期DNA长度添加1～2.5μLdNTP，补水至20μL。
[0018]进一步，第一轮PCR运行程序：94℃5min；94℃30s，54℃30s，72℃2min，30循环。
[0019]进一步，双片段组装为：上、下游片段各2μL，2
×
AssemblyMix4μL。
[0020]进一步，三片段组装为：F1、F2及F3片段各2μL，2
×
AssemblyMix6μL。
[0021]进一步，第二轮PCR运行程序：94℃5min；94℃30s，54℃30s，72℃3min，30循环。
[0022]进一步，步骤三中的DNA片段的酶切鉴定与序列分析包括：PCR产物经电泳检测后切取目标条带回收至20μLddH2O中；取10μL回收物加2μL10
×
buffer，0.5μL内切酶，补水至20μL；37℃孵育2h；酶切产物经1％琼脂糖凝胶电泳分析。选取适量DNA回收物进行序列测定，采用DNAMAN4.0软件进行序列比对。
[0023]结合上述的技术方案和解决的技术问题，本专利技术所要保护的技术方案所具备的优点及积极效果为：
[0024]第一，针对上述现有技术存在的技术问题以及解决该问本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种间插Gibson组装的OE
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PCR扩增方法，其特征在于，对于长基因及多DNA融合等常规OE
‑
PCR较困难的时候，采取间插Gibson组装的OE
‑
PCR扩增方法。包括：在获取各基因片段后，将基因片段等比例混合进行Gibson组装，再直接以组装混合物作为模板进行第二轮PCR扩增；在前后两轮PCR之间插入一次Gibson组装过程，使得DNA片段在较为温和的条件下更容易形成融合基因模板，以便在第二轮PCR中指数扩增。2.如权利要求1所述的间插Gibson组装的OE
‑
PCR扩增方...

【专利技术属性】
技术研发人员：陈华波，罗雪儿，陈明，王程君，刘君怡，李国庆，
申请(专利权)人：湖北文理学院，
类型：发明
国别省市：