基于液相色谱法检测血浆中25-羟基维生素D的方法技术

本发明专利技术涉及一种基于液相色谱法检测血浆中25

【技术实现步骤摘要】
基于液相色谱法检测血浆中25
‑
羟基维生素D的方法


[0001]本专利技术涉及血浆检测技术，尤其涉及一种有利于同时测定25
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羟基维生素D2与25
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羟基维生素D3，基于液相色谱法检测血浆中25
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羟基维生素D的方法。

技术介绍

[0002]维生素D是一种脂溶性维生素，也是一种类固醇激素。其中，维生素D2和维生素D3是人体功能性维生素D的两种主要类型，由于维生素D的主要存储形式是25
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羟基维生素D，且占总量的95％以上，因此，25
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羟基维生素D是公认的衡量维生素D营养状态的最佳指标，并且，维持正常的维生素D水平对调节钙、磷代谢至关重要。而在维生素D缺乏的情况下，人体仅能吸收大约10
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15％的钙和60％的磷，1,25
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二羟基维生素D通过与维生素D受体结合，可提高肠道对钙、磷的吸收效率，使钙吸收增加至30
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40％，磷吸收增加至80％左右。此外，维生素D的缺乏也与佝偻病、矮小症、骨质疏松症、糖尿病及高血压关系密切，过量会导致高钙血症和高钙尿症。
[0003]因此，针对25
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羟基维生素D的检测可用于评估患者体内维生素D的营养状况，其对维生素D缺乏的临床判断、治疗管理和生理评估具有辅助诊断的意义。
[0004]经过本领域技术人员对本领域各个常规技术手段其优劣之处的总结可知，目前25
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羟基维生素D的检测方法主要有免疫法、色谱法和质谱法。其中的免疫法测定易受基质、抗体等因素的影响，易导致测定结果准确度较低，且一般不能区分25
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羟基维生素D2与25
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羟基维生素D3，可见，检测范围较窄；其中的质谱法具有高灵敏度、高特异性、高准确度等优点，是公认的“金标准”，但质谱法设备昂贵、维护成本高，且质谱测试需要同位素标准品，试剂成本较贵，综合评定，该方法需要较高的成本耗费，显然，不可取。
[0005]本专利技术技术方案正是根据目前血浆中25
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羟基维生素D测定的检测需求的基础上，提供一种基于液相色谱法检测血浆中25
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羟基维生素D的方法，其相比以往所采用的质谱法具有明显的优势。

技术实现思路

[0006]针对检测方法存在的问题，本专利技术提供一种基于液相色谱法检测血浆中25
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羟基维生素D的方法，该方法在降低试剂成本的基础上，合理利用液相色谱法来实现同时测定25
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羟基维生素D2与25
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羟基维生素D3。
[0007]为实现上述目的，本专利技术采用以下技术方案：
[0008]一种基于液相色谱法检测血浆中25
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羟基维生素D的方法，其用于同时对血浆中的25
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羟基维生素D2与25
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羟基维生素D3进行提取检测，包括以下步骤：
[0009]步骤一：取300uL血清或血浆加入离心管，加入300uL第一试剂混匀1min，获得第一样本液，该第一试剂为含月桂基苯甲酮2ug/mL的乙醇溶液；
[0010]步骤二：再向离心管内加入800uL第二试剂，混匀5min，离心取600uL上清；
[0011]步骤三：继续向离心管内加入600uL第二试剂，混匀5min，离心取600uL上清，并与
第一份上清合并得第二样本液；
[0012]步骤四：将第二样本液以氮气吹干得固体物，加入100uL的50％异丙醇水溶液，最终获得待测样本；
[0013]步骤五：采用梯度洗脱方式，待测样本进样体积75uL注入HPLC
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UV进行检测；
[0014]步骤六：最后，根据检验色谱分析检测结果，25
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羟基维生素D2、25
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羟基维生素D3完全分离，不存在干扰，峰型对称。
[0015]此外，在校准品浓度范围内，拟合曲线线性相关系数r＞0.9900。
[0016]为促进技术效果的显著提升，技术人员还可采用相应的技术手段对以上技术方案进一步实施，包括：
[0017]对于步骤五，其检测条件还包括：选C18色谱柱或F5色谱柱、柱温为25
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50℃；
[0018]对于步骤五：其检测条件还包括所选取的流动相A相为含异丙醇的体积百分比≥1％，流动相B相A相为含异丙醇的体积百分比≥1％。
[0019]对于步骤一：其第一试剂由第一溶剂和抗氧化剂组成，其中的第一溶剂为甲醇、乙腈、乙醇、正丙醇、异丙醇中的一种或其任意组合形成的溶剂；
[0020]其中的月桂基苯甲酮浓度范围为0.5
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20ug/mL。
[0021]对于步骤二：其第二试剂由第二溶剂组成，此第二溶剂为正己烷、乙酸乙酯、氯仿、四氯化碳、环己烷、氯甲烷、二氯甲烷中的一种或其任意组合形成的溶剂；
[0022]其中，第二试剂用量为血清或血浆体积的1
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10倍。
[0023]结合应用效果，在同一构思基础上，技术人员还可采用实际的相应的技术手段来形成相应的技术方案，包括：
[0024]以上基于液相色谱法检测血浆中25
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羟基维生素D的方法，该提取检测方法在进行试剂盒配制时，还包括以下制备环节：
[0025]精确称取10mg的25
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羟基维生素D3转移至10mL的容量瓶内，加入乙醇，至25
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羟基维生素D3完全溶解后，加乙醇定容至10mL，得1mg/mL的25
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羟基维生素D3储备液，
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20℃保存；
[0026]精确称取5mg的25
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羟基维生素D2转移至10mL的容量瓶内，加入乙醇，至25
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羟基维生素D2完全溶解后，加乙醇定容至10mL，得0.5mg/mL的25
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羟基维生素D2储备液，
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20℃保存。
[0027]本专利技术在降低试剂成本的基础上，合理利用液相色谱法来实现同时测定25
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羟基维生素D2与25
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羟基维生素D3，相比以往所采用的质谱法具有明显的优势。
附图说明
[0028]下面根据附图对本专利技术作进一步详细说明。
[0029]图1是本专利技术所实施的基于液相色谱法检测血浆中25
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羟基维生素D的方法，其检验色谱示意图；
[0030]图2是本专利技术所实施的基于液相色谱法检测血浆中25
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羟基维生素D的方法，其25
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羟基维生素D3线性范围分析图；
[0031]图3是本专利技术所实施的基于液相色谱法检测血浆中25
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羟基维生素D的方法，其25
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羟基维生素D2线性范围分析图。
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【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种基于液相色谱法检测血浆中25
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羟基维生素D的方法，其特征在于，其用于同时对血浆中的25
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羟基维生素D2与25
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羟基维生素D3进行提取检测，包括以下步骤：步骤一：取300uL血清或血浆加入离心管，加入300uL第一试剂混匀1min，获得第一样本液，所述第一试剂为含月桂基苯甲酮2ug/mL的乙醇溶液；步骤二：再向离心管内加入800uL第二试剂，混匀5min，离心取600uL上清；步骤三：继续向离心管内加入600uL第二试剂，混匀5min，离心取600uL上清，并与第一份上清合并得第二样本液；步骤四：将第二样本液以氮气吹干得固体物，加入100uL的50％异丙醇水溶液，最终获得待测样本；步骤五：采用梯度洗脱方式，待测样本进样体积75uL注入HPLC
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UV进行检测；步骤六：再根据检验色谱分析检测结果，25
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羟基维生素D2、25
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羟基维生素D3完全分离，不存在干扰，峰型对称。2.根据权利要求1所述的基于液相色谱法检测血浆中25
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羟基维生素D的方法，其特征在于，在校准品浓度范围内，拟合曲线线性相关系数r＞0.9900。3.根据权利要求2所述的基于液相色谱法检测血浆中25
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羟基维生素D的方法，其特征在于，对于步骤五，其检测条件还包括：柱温为25
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50℃。4.根据权利要求1
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3任一项所述的基于液相色谱法检测血浆中25
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羟基维生素D的方法，其特征在于，对于步骤五：其检测条件还包括所选取的流动相A相为含异丙醇的体积百分比≥1％，流动相B相A相为含异丙醇的体积百分比≥1％。5.根据权利要求4所述的基于液相色谱法检测血浆中25
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羟基维生素D的方法，其特征在于，对于步骤一：其第一试剂由第一溶剂和抗氧化剂组成，...

【专利技术属性】
技术研发人员：陆佟，王桂平，
申请(专利权)人：安诺谱上海医疗科技有限公司，
类型：发明
国别省市：