一株高耐铜真菌TPD8制造技术

本发明专利技术公开了一株高耐铜真菌TPD8，属于微生物技术领域，所述高耐铜真菌TPD8为紫斑威氏菌(Westerdykella purpurea)，于2023年03月30日保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为：CGMCC NO.40546，本发明专利技术的高耐铜真菌能够修复重金属污染土壤，并且是一种具有成本效益和生态友好的方法。是一种具有成本效益和生态友好的方法。是一种具有成本效益和生态友好的方法。

【技术实现步骤摘要】
一株高耐铜真菌TPD8


[0001]本专利技术涉及微生物
，尤其是提供一株高耐铜真菌TPD8。

技术介绍

[0002]随着采矿、冶炼的快速发展，土壤中重金属积累量不断增加，因其具有长期性、隐蔽性、不可逆性的特点，很难从土壤中迁移，却可以通过食物链的流动转换对人体健康和自然环境产生严重危害。调查结果显示，铜作为主要污染物之一，其污染物点位超标率为2.1％。土壤中过量的铜不仅会对植物产生毒害，而且能够通过食物链的富集作用，对人类健康造成严重威胁。因此，筛选耐铜真菌、减少重金属污染已成为当前亟待解决的问题。
[0003]矿山开采和农田土壤利用的不断发展造成了一些生态问题，即土壤健康退化和土壤重金属污染。与土壤修复的传统方法相比较，利用微生物修复重金属污染土壤是一种具有成本效益和生态友好的方法。

技术实现思路

[0004]本专利技术的目的旨在通过制作微生物修复土壤的方法解决土壤铜污染的问题。
[0005]本专利技术公开了一株高耐铜真菌TPD8，所述高耐铜真菌TPD8为紫斑威氏菌(Westerdykel la purpurea)，于2023年03月30日保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为：CGMCC NO.40546。保藏地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号。
[0006]土壤样品采集及处理
[0007]土样采自安徽铜鑫矿业铜尾矿堆积地，去除土壤表面的浮土和杂草，采集土壤剖面深度20cm范围内的土样，以5cm为1个梯度，用梅花五点法分别采集不同土壤剖面的土样，置于无菌塑封袋中，记录好采集信息贴好标签带回实验室，置于4℃冰箱保存。将不同土壤深度的土样混合均匀，烘干，磨细过80目筛后备用。
[0008]土壤稀释液的制备
[0009]使用分析天平称取土壤样品5g，置于盛有45mL无菌水的三角瓶中，置于30℃、120r
·
min
‑1条件下的恒温摇床中振荡15min，使土样均匀分散，得到土样母液，制备土壤悬浮液。再用量程为1mL的无菌吸量管吸取1mL土样母液上清液加入盛有9mL无菌水的试管中，充分摇匀，得到土壤稀释液(10
‑2)。依次类推，制得10
‑1至10
‑4不同浓度的土壤稀释液。
[0010]耐铜真菌筛选培养基的制备
[0011]以马铃薯葡萄糖琼脂培养基(PDA)、玉米粉琼脂培养基(CMA)、水琼脂培养基(WA)为基本培养基，3种培养基分别加入CuSO4使培养基中初始Cu
2+
浓度为50mg/L，加入适量已抽滤除菌的链霉素抑制细菌的生长从而初步筛选耐铜真菌。
[0012]耐铜真菌的分离和筛选
[0013]将不同稀释倍数的土样液分别涂布于3种耐铜真菌筛选培养基上，每个浓度梯度设5个重复，于28℃恒温培养，每日观察记录；挑取单菌落，转接于新的培养基上，然后接种
到不同Cu
2+
浓度梯度的培养基上，每个Cu
2+
浓度梯度差为50mg/L，观察其生长情况，逐步筛选得到高耐铜能力的菌株。
[0014]本专利技术的有益效果:
[0015]本专利技术的高耐铜真菌能够修复重金属污染土壤，并且是一种具有成本效益和生态友好的方法。
附图说明
[0016]图1为筛选出的TPD27与TPD8高耐铜菌株。
[0017]图2为铜离子浓度标准曲线。
[0018]图3为两种菌株TPD27与TPD8富集Cu2+能力比较(p<0.05)。
[0019]图4为两种菌株TPD27与TPD8发酵液中Cu
2+
的清除能力比较(p<0.05)。
具体实施方式
[0020]为了使本专利技术的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下结合实施例，对本专利技术进行进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅用以解释本专利技术，并不用于限定本专利技术。
[0021]土壤样品采集及处理
[0022]土样采自安徽铜鑫矿业铜尾矿堆积地，去除土壤表面的浮土和杂草，采集土壤剖面深度20cm范围内的土样，以5cm为1个梯度，用梅花五点法分别采集不同土壤剖面的土样，置于无菌塑封袋中，记录好采集信息贴好标签带回实验室，置于4℃冰箱保存。将不同土壤深度的土样混合均匀，烘干，磨细过80目筛后备用。
[0023]土壤稀释液的制备
[0024]使用分析天平称取土壤样品5g，置于盛有45mL无菌水的三角瓶中，置于30℃、120r
·
min
‑1条件下的恒温摇床中振荡15min，使土样均匀分散，得到土样母液，制备土壤悬浮液。再用量程为1mL的无菌吸量管吸取1mL土样母液上清液加入盛有9mL无菌水的试管中，充分摇匀，得到土壤稀释液(10
‑2)。依次类推，制得10
‑1至10
‑4不同浓度的土壤稀释液。
[0025]耐铜真菌筛选培养基的制备
[0026]以马铃薯葡萄糖琼脂培养基(PDA)、玉米粉琼脂培养基(CMA)、水琼脂培养基(WA)为基本培养基，3种培养基分别加入CuSO4使培养基中初始Cu
2+
浓度为50mg/L，加入适量已抽滤除菌的链霉素抑制细菌的生长从而初步筛选耐铜真菌。
[0027]耐铜真菌的分离和筛选
[0028]将不同稀释倍数的土样液分别涂布于3种耐铜真菌筛选培养基上，每个浓度梯度设5个重复，于28℃恒温培养，每日观察记录；挑取单菌落，转接于新的培养基上，然后接种到不同Cu
2+
浓度梯度的培养基上，每个Cu
2+
浓度梯度差为50mg/L，观察其生长情况，逐步筛选得到高耐铜菌株。
[0029]耐铜真菌物种鉴定
[0030]形态鉴定
[0031]形态学方法使用显微镜观察菌落、菌丝以及孢子形态等，做好记录和拍照，并依据《真菌鉴定手册》、《真菌分类学》、《真菌学词典》第9版鉴定菌株。
[0032]分子鉴定
[0033]某些菌种的形态特征是不稳定的，仅进行形态鉴定可能影响真菌种类的判断。因此本实验结合DNA序列分析，使用真菌基因组DNA快速抽提试剂盒(Omega Bio
‑
Tek公司，HP Fungal DNA Kit D3195)，根据使用说明书中的详细操作步骤提取真菌DNA，选取引物ITS1
‑
F(5＇CTTGGTCATTTAGAGGAAGTAA 3＇)/ITS4(5＇TCCTCCGCTTATTGATATGC 3＇)进行PCR扩增，扩增体系为25μL，包括：正反向引物各1μL，模板DNA 2μL，Taq酶8.5μL，ddH2O 12.5μL。PCR扩增仪的扩增反应程序设置为：94℃条件下预变性3min，随后进入34个连续循环，94℃变性30s，51℃退火50s，72℃延伸55s，循环结束后于72℃条件下延伸10min，终止温度为4℃。部分真菌根据扩增结果调整退火温度，将琼本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一株高耐铜真菌TPD8，其特征在于，所述高耐铜真菌TPD8为紫斑威氏菌(Westerdykella purpurea)，于...

【专利技术属性】
技术研发人员：罗侠，杨梦梦，巩银平，
申请(专利权)人：滁州学院，
类型：发明
国别省市：