cAMP荧光探针R-Flamp2m及其应用和试剂盒制造技术

本发明专利技术涉及生物医学技术领域，具体涉及一种cAMP荧光探针R

【技术实现步骤摘要】
cAMP荧光探针R
‑
Flamp2m及其应用和试剂盒


[0001]本专利技术涉及生物医学
，具体涉及一种cAMP荧光探针R
‑
Flamp2m及其应用和试剂盒。

技术介绍

[0002]环磷酸腺苷(cAMP)是目前最大药物靶标G蛋白偶联受体(GPCR)家族的下游信使分子，细胞及活体水平的cAMP荧光成像是GPCR信号通路的基础研究和药物开发的重要方向。cAMP荧光探针主要分为基于荧光蛋白的荧光共振能量转移探针及基于单个荧光蛋白的探针，后者动态范围较前者大且使用简单。目前基于单个荧光蛋白的cAMP探针分为绿色和红色2小类，前者主要有Flamindo2、cADDis及cAMPr，后者主要有R
‑
Flamp1m、Pink Flamindo、Red cADDis及R
‑
FlincA。
[0003]活细胞中cAMP荧光成像是指将cAMP荧光探针表达在细胞中，然后利用荧光显微镜检测探针荧光的强度变化。荧光探针是cAMP荧光成像分析的关键。近几年，国际上知名实验室利用不同荧光蛋白、不同cAMP感应模块及不同的融合位点，开发了不同性能和光谱的cAMP单荧光蛋白探针，包括Tetsuya Kitaguchi博士开发的Flamindo/Flamindo2/Pink Flamindo探针、Anne Marie Quinn博士开发的cADDis/Red cADDis探针、Kazuki Horikawa博士开发的R
‑
FlincA探针及Justin Blau博士开发的cAMPr探针。对于绿色cAMP探针，申请人已开发更高性能的探针G
‑
Flamp1(CN201911251920.X和CN202010354936.X)。
[0004]相较于短波长的绿色探针，长波长的红色探针具有诸多优点：(1)红色探针能够与已有的大量绿色探针或者蓝光敏感的工具蛋白联合使用；(2)红色探针具有更低的荧光背景干扰、更小的光毒性和更深的组织穿透能力。
[0005]然而对于cAMP探针，现有的红色探针具有以下不足：(1)在37℃培养哺乳动物细胞中亮度很低，不利于细胞的定位和神经元树突等微小细胞结构的观察。(2)在37℃培养哺乳动物细胞中动态范围(荧光亮度变化幅度ΔF/F0)很小，严重影响检测灵敏度。
[0006]因此，开发高性能红色探针，提高其在实际应用中的亮度和动态范围，对于提高探测灵敏度具有重要意义。

技术实现思路

[0007]本专利技术的目的在于克服上述技术问题，提供一种动态范围大、检测灵敏度高，可检测细胞受刺激后cAMP浓度改变，可与已有的大量绿色探针或者蓝光敏感的工具蛋白联合使用，同时进行双色成像或者进行光学控制/荧光成像联用的cAMP荧光探针R
‑
Flamp2m及其应用和试剂盒。
[0008]为实现上述目的，本专利技术采用的技术方案为：
[0009]一种cAMP荧光探针R
‑
Flamp2m，所述的R
‑
Flamp2m的氨基酸序列如SEQ ID NO：1所示。
[0010]进一步的，所述的荧光探针R
‑
Flamp2m单光子的激发波长峰值为570nm。
[0011]进一步的，所述的荧光探针R
‑
Flamp2m可在单光子的激发波长为550
‑
570nm下使用。
[0012]本专利技术还提供一种cAMP荧光探针R
‑
Flamp2m的制备方法。
[0013]一种cAMP荧光探针R
‑
Flamp2m的制备方法，所述的方法为：以能够结合cAMP的mEpac1为感应结构域，与mApple荧光蛋白连接，经过若干氨基酸突变，即得到R
‑
Flamp2m探针；
[0014]R
‑
Flamp2m的氨基酸序列如SEQ ID NO：1所示。
[0015]本专利技术还提供一种活细胞中cAMP荧光成像检测方法。
[0016]一种活细胞中cAMP荧光成像检测方法，所述的方法包括以下步骤：
[0017](1)活体细胞培养，细胞密度60
±
5％时，转染R
‑
Flamp2m质粒；
[0018](2)转染后的细胞培养过夜，饥饿细胞2～4h后，将培养基换为无色透明的缓冲液；
[0019](3)单光子的激发波长550
‑
570nm下，荧光显微镜成像分析。
[0020]本专利技术还提供一种哺乳动物细胞中cAMP荧光成像检测方法。
[0021]一种哺乳动物细胞中cAMP荧光成像检测方法，所述的方法包括以下步骤：
[0022](1)哺乳动物细胞培养，培养基为含10％胎牛血清和1％penicillin
‑
streptomycin的DMEM，培养温度为37℃，CO2含量为5％；
[0023]细胞密度60
±
5％时，用Lipofectamine 2000试剂盒转染R
‑
Flamp2m质粒；
[0024](2)转染后的哺乳动物细胞培养过夜，用不含血清和酚红的培养基饥饿细胞2～4h后，将培养基换为无色透明的荧光成像用缓冲液；
[0025](3)荧光显微镜成像分析，其中单光子的激发波长550～570nm。
[0026]本专利技术还提供另一种哺乳动物细胞中cAMP荧光成像检测方法。
[0027]一种哺乳动物细胞中cAMP荧光成像检测方法，所述的方法包括以下步骤：
[0028](1)哺乳动物细胞培养，培养基为含10％胎牛血清和1％penicillin
‑
streptomycin的DMEM，培养温度为37℃，CO2含量为5％；
[0029]细胞密度60
±
5％时，用Lipofectamine 2000试剂盒转染R
‑
Flamp2m质粒；
[0030](2)转染后的哺乳动物细胞培养过夜，用不含血清和酚红的培养基饥饿细胞2～4h后，将培养基换为无色透明的荧光成像用缓冲液；
[0031](3)单光子的激发波长550
‑
570nm，荧光显微镜成像分析，成像频率为每15秒一帧，在第十帧加入Forskolin，至Forskolin终浓度60μM，检测R
‑
Flamp2m探针荧光的强度变化。
[0032]本专利技术还提供一种cAMP荧光探针R
‑
Flamp2m的应用。
[0033]一种cAMP荧光探针R
‑
Flamp2m在检测cAMP中的应用。
[0034]本专利技术还提供另一种cAMP荧光探针R
‑
Flamp2m的应用。
[0035]一种cAMP荧光探针R
‑
Flamp2m在活细胞和/或动物活本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种cAMP荧光探针R
‑
Flamp2m，其特征在于：所述的R
‑
Flamp2m的氨基酸序列如SEQ ID NO:1所示。2.根据权利要求1所述的一种cAMP荧光探针R
‑
Flamp2m，其特征在于：所述的荧光探针R
‑
Flamp2m在单光子的激发波长为550
‑
570nm下使用。3.根据权利要求1或2所述的一种cAMP荧光探针R
‑
Flamp2m，其特征在于：所述的荧光探针R
‑
Flamp2m单光子的激发波长峰值为570nm。4.一种cAMP荧光探针R
‑
Flamp2m的制备方法，其特征在于，所述的方法为：以能够结合cAMP的mEpac1为感应结构域，与mApple荧光蛋白连接，经过若干氨基酸突变，即得到R
‑
Flamp2m探针；R
‑
Flamp2m的氨基酸序列如SEQ ID NO:1所示。5.一种活细胞中cAMP荧光成像检测方法，其特征在于，所述的方法包括以下步骤：(1)活体细胞培养，细胞密度60
±
5％时，转染R
‑
Flamp2m质粒；(2)转染后的细胞培养过夜，饥饿细胞2～4h后，将培养基换为无色透明的缓冲液；(3)单光子的激发波长550
‑
570nm下，荧光显微镜成像分析。6.一种哺乳动物细胞中cAMP荧光成像检测方法，其特征在于，所述的方法包括以下步骤：(1)哺乳动物细胞培养，培养基为含10％胎牛血清和1％penicillin
‑
strep...

【专利技术属性】
技术研发人员：储军，王亮，
申请(专利权)人：中国科学院深圳先进技术研究院，
类型：发明
国别省市：