使用加有锇标签的互补探针进行阿托摩尔DNA/RNA寡核苷酸检测的即用型纳米孔平台制造技术

本文提供了一种用于检测生物样品中核酸靶分子的存在的方法。在某些方面，所述方法包括接触测试样品，所述测试样品包含(i)生物样品，其包含核酸靶分子，和(ii)锇化单链寡核苷酸探针，其包含至少一个与取代或未取代的四氧化锇(OsO4)

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】使用加有锇标签的互补探针进行阿托摩尔DNA/RNA寡核苷酸检测的即用型纳米孔平台
[0001]以电子方式递交的序列表的引用
[0002]与本申请一起提交的ASCII文本文件(名称68812_199738_ST25.txt；大小：6755字节；创建日期：2020年10月2日)形式的以电子方式递交的序列表的内容通过引用整体并入本文。关于联邦政府赞助研究和开发的声明
[0003]本专利技术是在NIH/NHGRI SBIR计划授予的基金号R43HG010841下借助美国政府的支持完成的。美国政府拥有本专利技术的某些权利。

技术介绍

[0004]被称为液体活检的抽血或其他体液样品(Bronkhorst,A.J.、Ungerer,V.和Holdenrieder,S.(2019)；Vidal,J.、Taus,A.和Montagut,C.(2020)；O.、O.、Szemes,T.和Nagy,B.(2018)；Oellerich,M.、Sch
ü
tz,E.、Beck,J.和Walson,P.D.(2019)；Stewart,C.M.和Tsui,D.(2018)；Giannopoulou,L.、Kasimir
‑
Bauer,S.和Lianidou,E.S.(2018)；Satyal,U.、Srivastava,A.和Abbosh,P.H.(2019)；Finotti,A.等人(2018)；Valpione,S.和Campana,L.(2019)；以及Kwapisz D.(2017))包含关于个体的健康状况、疾病进展、个体在手术后是否无病以及甚至某种治疗策略是否似乎有希望的相关信息(Vidal,J.、Taus,A.和Montagut,C.(2020))。液体活检是侵入性远低于手术/肿瘤活检的程序。体液含有细胞游离DNA(cfDNA)，其中的一部分可能来源于肿瘤(循环肿瘤DNA；ctDNA)。2016年，美国食品和药物管理局(US Food and Drug Administration)批准了第一个针对非小细胞肺癌患者的EGFR激活突变的液体活检测试作为伴随诊断测试，以实现疗法选择(Kwapisz D.(2017))。据信，与健康个体相比，患病个体的细胞游离DNA是片段化且较短的(O.、Bir
ó
,O.、Szemes,T.和Nagy,B.(2018))。除DNA外，体液还包含转移RNA衍生片段和在20至300个核苷酸(nt)范围内的非编码RNA寡核苷酸(Kim HK、Yeom JH、Kay MA.(2020)；Poller W等人(2018)；Mitchell,P.等人(2008)；Aggarwal,V.、Priyanka,K.和Tuli,H.S.(2020)；Meseure,D.、Drak Alsibai,K.、Nicolas,A.、Bieche,I.和Morillon,(2015))。其中有一组单链(ss)RNA，长17至25nt，称为微小RNA或miRNA。它们在20年前被发现并被证明是控制蛋白质的转录后表达的微小调控剂(Ambros,V.(2001)；Bartel,D.P.(2004))。miRNA在体液中高度保守并且出人意料地稳定(Mitchell,P.等人(2008)；Mall,C.、Rocke,D.M.、Durbin
‑
Johnson,B.和Weiss,R.H.(2013))。目前已知超过2,300种人miRNA(Alles J.等人(2019))，它们是超过100,000篇科学出版物的主题。miRNA的上调或下调与多种人类疾病相关，包括癌症、心脏病、肾病、肥胖症、糖尿病等(Bartel,D.P.(2004))；miRNA被提议在个性化医疗中作为生物标志物(Farazi,T.A.、Hoell,J.I.、Morozov,P.和Tuschl,T.(2013)；Pogribny,I.P.(2017))和潜在治疗剂(Rupaimoole,R.和Slack,F.J.(2017))。体液含有痕量的cfDNA、ctDNA、片段化的编码RNA(Kim HK、Yeom JH、Kay MA.(2020))、非编码RNA(Poller W等人(2018))和miRNA，它们需要简单、经过验证且高度敏感的测定来测试(Finotti,(2018)；Valpione,S.和Campana,L.(2019)；Raabe,C.、Tang T.、Brosius J.和
Rozhdestvensky,T.(2014))。目前用于“小RNA”鉴定和量化的技术包括微阵列、NGS测序(Ion Torrent或Illumina(小RNA
‑
seq))，以及迄今为止已取得巨大成功的基于qRT
‑
PCR的方法(Ferracin,M.和Negrini,M.(2018)；Valihrach,L.、Androvic,P.和Kubista,M.(2020)；Gines,G.、Menezes,R.、Xiao,W.、Rondelez,Y.、Taly,V.(2020))。然而，这些技术需要大量的基础设施和熟练人员，不适合即时测试，并且绝不可能用于家庭测试。
[0005]在过去的30年里，使用固态或蛋白质纳米孔的基于纳米孔的技术激增(Kasianowicz,J.J.、Brandin,E.、Branton,D.和Deamer,D.W.(1996)；Butler,T.Z.、Gundlach,J.H.和Troll,M.(2007)；Maglia,G.、Heron,A.J.、Stoddart,D.、Japrung,D.和Bayley,H.(2010)；Haque,F.、Li,J.、Wu,H.C.、Liang,X.J.和Guo,P.S(2013)；Fuller C.W.等人(2016)；Laszlo,A.H.等人(2014)；Oxford Nanopore Technologies网站：nanoporetech.com，在Resources/Publications下)。2014年，Oxford Nanopore Technologies(ONT)推出并商业化了第一款便携式纳米孔装置，几乎可以在任何地方对DNA和RNA进行测序，只要有计算机和互联网即可(Oxford Nanopore Technologies网站：nanoporetech.com，在Resources/Publications下)。ONT技术基于CsGg蛋白质纳米孔(Cao,B.等人(2014))，其具有小于2nm的直径，插入将两个填充有电解质的隔室分开的平面脂质双层膜中(图1A)。跨两个隔室施加电压导致通过孔的电解质离子的恒流(I
o
)，记录为时间函数(i
‑
t)。单个分子通过孔将I
o
降低至较低水平的残余离子电流(I
r
)。这被记录为具有(I
r
)和停留时间(τ)的“事件”(图1B)。目前，ONT平台专门用于DNA/RNA测序(Oxford Nanop本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】1.一种用于检测生物样品中核酸靶分子的存在的方法，所述方法包括以下步骤：(a)接触测试样品，所述测试样品包含(i)生物样品，其包含核酸靶分子，和(ii)锇化单链寡核苷酸探针，其包含至少一个与取代或未取代的四氧化锇(OsO4)
‑
2,2
’‑
联吡啶基团(OsBp基团)共价键合的嘧啶残基，其中所述探针的序列与所述核酸靶分子的序列至少部分互补，以允许形成杂交的探针/靶标复合物，任选地，其中至少一个锇化嘧啶残基是胸苷残基(T)；(b)使用纳米孔装置检测所述测试样品中的其中未杂交的锇化探针穿过纳米孔的事件的数量；以及(c)(i)将在所述测试样品中检测到的所述事件数量与其中未杂交的锇化探针在不存在所述核酸靶标的情况下穿过所述纳米孔的相应探针样品事件的数量相比较，其中在所述测试样品中检测到的所述事件数量相对于所述探针样品事件数量的减少指示在步骤(a)中形成所述杂交的探针/靶标复合物并且在所述测试样品中存在所述核酸靶分子；(c)(ii)将在所述测试样品中检测到的所述事件数量与不含任何锇化探针的相应基线样品的噪声相比较，其中在所述测试样品中检测到的所述事件数量相对于所述基线样品的噪声没有增加指示在步骤(a)中形成所述杂交的探针/靶标复合物并且在所述测试样品中存在所述核酸分子；和/或(c)(iii)将在所述测试样品中检测到的所述事件数量与其中未杂交的锇化探针在存在已知量的所述核酸靶分子的情况下穿过所述纳米孔的相应对照样品事件的数量相比较，其中在所述测试样品中检测到的所述事件数量相对于所述对照样品事件数量的减少指示步骤(a)中的所述杂交的探针/靶标复合物的形成增加并且在所述测试样品中存在比所述对照样品中更大量的所述核酸靶分子，或其中使用相同量的探针在所述测试样品中检测到的所述事件数量相对于所述对照样品事件数量的增加指示更多的未杂交探针并且因此指示与所述对照样品相比，所述测试样品中的所述核酸靶分子的量更低；任选地：其中所述纳米孔装置不需要为了检测所述探针而将所述探针缀合于蛋白质、纳米颗粒、均聚物或多肽，或其中所述探针不缀合于蛋白质、纳米颗粒、均聚物或多肽；和/或，其中检测不是通过对由阻塞所述纳米孔的所述杂交的探针/靶标复合物产生的长阻滞进行计数或通过在所述纳米孔中将杂交的探针/靶标复合物解链来实现的。2.根据权利要求1所述的方法，其包括以下步骤：(c)(i)将在所述测试样品中检测到的所述事件数量与其中未杂交的锇化探针在不存在所述核酸靶标的情况下穿过所述纳米孔的相应探针样品事件的数量相比较，其中在所述测试样品中检测到的所述事件数量相对于所述探针样品事件数量的减少指示在步骤(a)中形成所述杂交的探针/靶标复合物并且在所述测试样品中存在所述核酸靶分子；和/或(c)(ii)将在所述测试样品中检测到的所述事件数量与不含任何锇化探针的相应基线样品的噪声相比较，其中在所述测试样品中检测到的所述事件数量相对于所述基线样品的噪声没有增加指示在步骤(a)中形成所述杂交的探针/靶标复合物并且在所述测试样品中存在所述核酸分子。3.根据权利要求1所述的方法，其包括以下步骤：(c)(i)将在所述测试样品中检测到的
所述事件数量与其中未杂交的锇化探针在不存在所述核酸靶标的情况下穿过所述纳米孔的相应探针样品事件的数量相比较，其中在所述测试样品中检测到的所述事件数量相对于所述探针样品事件数量的减少指示在步骤(a)中形成所述杂交的探针/靶标复合物并且在所述测试样品中存在所述核酸靶分子。4.根据权利要求1至3中任一项所述的方法，其中所述相应探针样品事件数量是在检测所述测试样品中的所述事件数量时在一个或多个探针样品中同时检测到的事件数量和/或是针对给定量的探针的预先确定值；任选地，其中针对给定量的探针的所述探针样品事件数量的所述预先确定值已经根据经验确定或已经从理论上确定；进一步任选地，其中在检测所述探针样品事件数量之后，将所述探针样品中的所述锇化探针与生物样品组合以产生测试样品，并且接着检测所述测试样品中的所述事件数量以与所述探针样品事件数量相比较。5.根据权利要求1所述的方法，其包括以下步骤：(c)(ii)将在所述测试样品中检测到的所述事件数量与不含任何锇化探针的相应基线样品的噪声相比较，其中在所述测试样品中检测到的所述事件数量相对于所述基线样品的噪声没有增加指示在步骤(a)中形成所述杂交的探针/靶标复合物并且在所述测试样品中存在所述核酸分子。6.根据权利要求1、2或5中任一项所述的方法，其中相应基线样品的噪声是在检测所述测试样品中的所述事件数量时在一个或多个基线样品中同时确定的和/或是针对特定组成的基线样品的预先确定的噪声值；任选地，其中基线样品的所述预先确定的噪声值已经根据经验确定或已经从理论上确定；进一步任选地，其中在确定基线样品的噪声后，将所述锇化探针添加到所述基线样品中以产生所述测试样品，并且接着检测所述测试样品的所述事件数量以与所述基线样品的噪声相比较。7.根据权利要求1所述的方法，其包括以下步骤：(c)(iii)将在所述测试样品中检测到的所述事件数量与其中未杂交的锇化探针在存在已知量的所述核酸靶分子的情况下穿过所述纳米孔的相应对照样品事件的数量相比较，其中在所述测试样品中检测到的所述事件数量相对于所述对照样品事件数量的减少指示步骤(a)中的所述杂交的探针/靶标复合物的形成增加并且在所述测试样品中存在比所述对照样品中更大量的所述核酸靶分子，或其中使用相同量的探针在所述测试样品中检测到的所述事件数量相对于所述对照样品事件数量的增加指示更多的未杂交探针并且因此指示与所述对照样品相比，所述测试样品中的所述核酸靶分子的量更低。8.根据权利要求1或7所述的方法，其中所述相应对照样品事件数量是在检测所述测试样品中的所述事件数量时在一个或多个对照样品中同时检测到的事件数量和/或是针对与给定量的核酸靶分子混合的给定量的探针的预先确定值；任选地，其中针对与给定量的核酸靶分子混合的给定量的探针的对照样品事件数量的所述预先确定值已经根据经验确定或已经从理论上确定。9.根据权利要求1至8中任一项所述的方法，其中所述测试样品中的所述探针的量约等于或小于所述测试样品中的靶核酸分子的量。
10.根据权利要求1至9中任一项所述的方法，其中所述OsBp基团中的2,2
’‑
联吡啶是取代的；任选地，其中所述OsBp基团中的2,2
’‑
联吡啶被一个或多个甲基或乙基取代。11.根据权利要求1至10中任一项所述的方法，其中：(i)所述探针是DNA，并且任选地其中所述核酸骨架中的糖中的至少一种是2
’‑
OMe
‑
脱氧核糖；或者(ii)所述探针是RNA，并且任选地其中所述核酸骨架中的糖中的至少一种是2
’‑
OMe
‑
核糖。12.根据权利要求1至11中任一项所述的方法，其中所述锇化探针具有约12至50个核苷酸的长度；任选地，其中与所述靶核酸分子的序列至少部分互补的所述探针的部分缺少多于2个核苷酸的连续自我互补序列和/或是非结构化的/不自我杂交。13.根据权利要求1至12中任一项所述的方法，其中所述核酸靶标是循环肿瘤DNA(ctDNA)、细胞游离DNA(cfDNA)、miRNA、片段化的编码RNA或非编码RNA，任选地，其中所述非编码RNA的长度小于约300个碱基；任选地，其中所述核酸靶分子是单链核酸分子；和/或其中所述方法还包括在步骤(a)中使所述样品中的双链核酸变性以形成单链核酸链，使得所述单链寡核苷酸探针能够与单链靶分子杂交。14.根据权利要求1至13中任一项所述的方法，其中：(i)所述锇化探针包含至少两个、三个、四个、五个或六个锇化嘧啶残基，任选地，其中所述锇化探针包含至少两个、三个、四个、五个或六个锇化胸苷残基(T)；(ii)所述锇化探针包含至少两个、三个或四个相邻的锇化嘧啶残基，任选地，其中所述锇化探针包含至少两个、三个或四个相邻的锇化胸苷残基(T)；和/或，(iii)所述锇化探针在所述探针的5
’
末端或3
’
末端包含一个、两个、三个、四个、五个或六个腺苷残基(dA或A)，任选地，其中所述5
’
末端或3
’
末端腺苷残基中的一个或多个不与所述靶核酸分子杂交，任选地，其中所述5
’
末端或3
’
末端腺苷残基(dA或A)中没有一个与所述靶核酸分子杂交。15.根据权利要求1至14中任一项所述的方法，其中：(i)所述锇化探针包含至少两个、三个或四个位于所述探针的5
’
末端或3
’
末端的相邻的锇化嘧啶残基，任选地，其中所述5
’
末端或3
’
末端嘧啶残基中的一个或多个不与所述靶核酸分子杂交，任选地，其中所述5
’
末端或3
’
末端嘧啶残基中没有一个与所述靶核酸分子杂交；任选地，其中所述锇化探针包含至少两个、三个或四个位于所述探针的5
’
末端或3
’
末端的相邻的锇化胸苷残基(T)，任选地，其中所述5
’
末端或3
’
末端胸苷残基(T)中的一个或多个不与所述靶核酸分子杂交，任选地，其中所述5
’
末端或3
’
末端胸苷残基(T)中没有一个与所述靶核酸分子杂交；和/或，
(ii)所述锇化探针不包含两个或更多个不位于所述探针的5
’
末端或3
’
末端的相邻的锇化嘧啶残基，任选地，其中所述锇化探针不包含两个或更多个不位于所述探针的5
’
末端或3
’
末端的相邻的锇化胸苷残基(T)。16.根据权利要求1至15中任一项所述的方法，其中与所述靶标互补的所述寡核苷酸探针分子的序列内至少约95％、96％、97％、98％、99％或100％的嘧啶残基未被锇化。17.根据权利要求1至16中任一项所述的方法，其中所述寡核苷酸探针分子中至少约95％、96％、97％、98％、99％或100％的胸苷残基(T)被锇化，和/或，其中除胸苷(T)外，存在于所述探针中的至少约80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％的嘧啶未被锇化。18.根据权利要求1至17中任一项所述的方法，其中所述探针是DNA，但其中除了位于5
’
末端或3
’
末端的相邻胸苷残基(T)之外，所述探针序列中的至少一个胸苷残基(T)被尿苷(U)、2
’‑
OMeU(mU)或脱氧尿苷(dU)残基替代；任选地，其中除了位于5
’
末端或3
’
末端的相邻胸苷残基(T)之外，所述探针序列中至少约80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％的胸苷残基(T)被尿苷(U)、2
’‑
OMeU(mU)或脱氧尿苷(dU)残基替代。19.根据权利要求1至18中任一项所述的方法，其中通过使包含取代或未取代的2,2
’‑
联吡啶和OsO4(锇化试剂)的水溶液与寡核苷酸探针反应以形成2,2
’‑
联吡啶
‑
OsO4缀合探针，并且任选地，从过量的锇化试剂中纯化所述缀合探针来制备所述锇化探针；任选地，其中所述溶液中的2,2
’‑
联吡啶/OsO4比率为约0.80/1.0、0.85/1.0、0.90/1.0、0.95/1.0、0.97/1.0、0.98/1.0、0.99/1.0、1.0/1.0、...

【专利技术属性】
技术研发人员：阿纳斯塔西娅，
申请(专利权)人：阿纳斯塔西娅，
类型：发明
国别省市：