提高体内基因递送心脏特异性的核酸调控元件组合及应用制造技术

本发明专利技术提供了一种提高体内基因递送心脏特异性的核酸调控元件组合、包含该核酸调控元件组合的腺相关病毒载体及其制备方法、以及该核酸调控元件组合或腺相关病毒载体的用途，特别适合运用于CRISPR/Cas9基因编辑系统或Cre

【技术实现步骤摘要】
提高体内基因递送心脏特异性的核酸调控元件组合及应用


[0001]本专利技术涉及生物医药领域，具体涉及能够提高体内基因递送心脏特异性的核酸调控元件组合及应用。

技术介绍

[0002]对于因基因突变等因素导致的遗传性疾病来说，基因治疗是很有前景的治疗手段，其基本的治疗思路为在患者体内补充正常的基因、沉默有害的基因或者将特定基因突变位点的碱基或片段纠正为正常序列，从而有望治愈遗传性疾病。例如，2017年美国FDA批准的治疗莱伯氏先天性黑蒙(Leber congenital amaurosis，LCA)的Luxturna基因疗法，通过以AAV作为载体携带正常的RPE65基因，直接注射到RPE65基因发生突变患者的眼底，在视网膜细胞表达正常的RPE65基因，从而使患者丧失的视力得以恢复。在基因突变导致的某些疾病中，单纯补充正常的基因并不能解决突变造成的细胞功能障碍。这时，基因治疗需要通过沉默突变的或有害的基因达到治疗目的。或者，需要对突变的基因进行修正，即应用基因编辑等技术把突变的位点或序列修改为正常的位点或序列才能起到治疗作用(基因治疗：过去、现在和未来，刘国庆等，中国医药导刊，第25卷第1期，第9
‑
12页，2023年)。
[0003]心脏疾病是严重危害人类健康的疾病，随着对心脏疾病致病基因及其分子机制的深入研究，已有通过基因治疗手段来调控特定基因表达水平和改善基因分子功能从而达到防治心脏疾病的目的的研究被报导，并且目前针对心脏疾病的基因治疗方案的研究已取得多项进展。基因疗法已成为治疗和治愈受损心脏组织的一种有前景的方法，能够使心脏从功能受损的状态恢复到正常状态。特别是，随着基因组编辑技术的发展，通过基因编辑技术直接在体内修复致病突变或者敲除特定基因进行心脏疾病防治的基因方法也得到广泛关注(心血管疾病的基因治疗，丁秋蓉等，上海大学学报自然科学版，第22卷第3期，第270
‑
279页，2016年)。
[0004]增加心肌组织中的有益基因的表达或者降低心肌组织中有害基因的表达也是心脏疾病基因治疗的基本思路之一，即使该心脏疾病属于非遗传性的心脏疾病亦是有效的。例如，钙离子/钙调蛋白依赖性激酶II(Ca
2+
/calmodulin
‑
dependent kinase II，CaMKII)是丝氨酸
‑
苏氨酸激酶家族成员之一，在心脏中以CaMKII δ亚型为主，CAMK2D是编码CaMKII δ的基因。CAMK2D表达升高，CaMKII δ的异常激活与心律失常、心肌病、心肌梗死、心力衰竭等的发生相关，因此CAMK2D被认为是心脏疾病的一个关键的治疗靶点(Bezzerides VJ等.Gene Therapy和rCatecholaminergic Polymorphic Ventricular Tachycardia by Inhibition of Ca2+/Calmodulin
‑
Dependent Kinase II.Circulation.140(5)：405
‑
419，2019)。
[0005]在开发针对心脏疾病的基因治疗方法时，用于将具有预防或治疗作用的基因递送至治疗靶细胞的载体系统是开发策略的重要方面，特别是针对心脏细胞具有高度特异性的载体系统尤其具有价值。腺相关病毒(AAV)载体因其良好的安全性和较弱的机体炎症反应被认为是目前最具临床应用前景的病毒载体，目前已发现超过100种不同血清型的AAV载
体，其中AAV1、AAV6、AAV8、AAV9血清型被认为具有较高的心脏特异性，特别是AAV9(人9型腺相关病毒)是感染心脏细胞最有效的血清型(心血管疾病的基因治疗，丁秋蓉等，上海大学学报自然科学版，第22卷第3期，第270
‑
279页，2016年)。然而，AAV9也可以感染肝脏、肺脏、肾脏等其他器官。因此，为了提高AAV9递送的目的基因在心脏细胞中的特异性表达，常采用心脏特异性启动子，例如心肌肌钙蛋白T的启动子(Tnnt2或cTnT)。在已发表的研究中，AAV9
‑
Tnnt2系统被认为有良好的心脏靶向性，因此将其用于心脏疾病研究和治疗的载体(Prasad K M等，Robust cardiomyocyte
‑
specific gene expression following systemic injection of AAV：in vivo gene delivery follows a Poisson distribution，Gene Ther.，18：43
‑
52，2011)。AAV9
‑
Tnnt2作为传统的心脏特异性基因递送工具，在基因过表达等表达量较高的转基因环境下，采用灵敏检测的方法未明显检测到AAV9
‑
Tnnt2递送基因在肝脏等其他器官中存在泄漏。随着基因重组、基因编辑等技术的发展，有研究发现AAV9
‑
TNT4
‑
Cre在肝脏、肺脏等器官存在泄漏情况(Werfel S等，Rapid and highly efficient inducible cardiac gene knockout in adult mice using AAV
‑
mediated expression of Cre recombinase，Cardiovasc Res.，104(1)：15
‑
23，2014)。
[0006]特别是，对于低表达转基因反应灵敏的应用场景，例如在CRISPR/Cas9基因编辑系统或Cre
‑
Loxp重组系统等基因编辑系统中，即使是低水平或瞬时的基因表达也足以引发严重的生物学后果，导致基因治疗的安全性降低。因此，如何提高AAV9体内递送基因的心脏特异性并降低其在肝脏中的泄漏，成为心脏疾病的基因治疗领域亟待解决的技术问题。

技术实现思路

[0007]针对上述技术问题，专利技术人经过试验和研究，创造性地提供了本专利技术的解决方案。
[0008]在第一方面，本专利技术提供了一种提高体内基因递送心脏特异性的核酸调控元件组合，包含(i)至少一种心脏特异性启动子，和(ii)miR122TS；其中，所述miR122TS的序列为：(a)SEQ ID NO：1所示的DNA序列，或者(b)与SEQ ID NO：1所示序列相比具有1
‑
3个碱基差异并且同时仍能被miR122靶向结合的DNA序列。
[0009]在第一方面或其他方面的一些实施方式中，本专利技术所述的至少一种心脏特异性启动子包括Tnnt2、cTNT、MYH6、MYL2和/或ANF中的一种或多种。优选地，本专利技术所述的至少一种心脏特异性启动子为Tnnt2。
[0010]在第一方面或其他方面的一些实施方式中，本专利技术所述的核酸调控元件组合通过对心脏具有亲和性的AAV递送。优选地，所述对心脏具有亲和性的AAV为AAV本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种提高体内基因递送心脏特异性的核酸调控元件组合，包含(i)至少一种心脏特异性启动子，和(ii)miR122TS；其中，所述miR122TS的序列为：(a)SEQ ID NO：1所示的DNA序列，或者(b)与SEQ ID NO：1所示序列相比具有1
‑
3个碱基差异并且同时仍能被miR122靶向结合的DNA序列。2.根据权利要求1所述的核酸调控元件组合，其中所述至少一种心脏特异性启动子包括Tnnt2、cTNT、MYH6、MYL2和/或ANF中的一种或多种。3.根据权利要求1所述的核酸调控元件组合，其中所述核酸调控元件组合通过对心脏具有亲和性的AAV递送。4.根据权利要求3所述的核酸调控元件组合，其中所述AAV为选自AAV2i8、AAV1、AAV6、AAV8、AAV9和/或MyoAAV中的一种或多种。5.根据权利要求3或4所述的核酸调控元件组合，其中所述miR122TS位于所述AAV的基因的3
′
UTR中。6.一种提高体内基因递送心脏特异性的腺相关病毒载体，包含：(i)AAV，和(ii)核酸调控元件组合；其中，所述核酸调控元件组合为根据权利要求1
‑
5中任一项所述的核酸调控元件组合，并且其中所述miR122TS位于所述AAV的基因的3
′
UTR中；其中，所述AAV为选自AAV2i8、AAV1、AAV6、AAV8、AAV9和/或MyoAAV中的一种或多种。7.一种制备根据权利要求6所述的腺相关病毒载体的方法，所述腺相关病毒...

【专利技术属性】
技术研发人员：郭宇轩，杨璐梓，
申请(专利权)人：北京大学，
类型：发明
国别省市：