本发明专利技术提供了一种微量FFPE组织蛋白质组学前处理技术及质谱分析策略，该技术采用微量FFPE样品丙酮沉淀(MicroAP)前处理方法：本方法无需脱石蜡，在同一容器中依次进行蛋白去交联及提取、蛋白的还原烷基化反应、酶解、除盐等一系列前处理过程，最后将肽段注入质谱通过DirectDIA的质谱数据采集模式进行分析。本发明专利技术能够为微量的FFPE组织(如单个肾小球)进行蛋白质组学研究提供可行的技术支撑，应用本发明专利技术的前处理方法和结合DirectDIA质谱分析策略，从单个肾小球FFPE组织中可成功鉴定到约3000个蛋白，有效提高临床各类微量FFPE组织样本的利用率，保障临床蛋白质组学研究的顺利开展，本发明专利技术方法优于现有的检测技术，且实验成本低、操作更简便。操作更简便。操作更简便。
【技术实现步骤摘要】
一种微量福尔马林固定石蜡包埋(FFPE)组织的蛋白质组学分析方法
[0001]本专利技术涉及分析检测
，具体涉及一种微量FFPE组织蛋白质组学前处理技术和质谱分析策略及其应用。
技术介绍
[0002]福尔马林固定石蜡包埋(formalin fixation and paraffin
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embedding,FFPE)组织是医院定期归档用于诊断目的的活检组织标本。FFPE组织可通过标准且常见方式来处理，稳定性良好，室温储存数年或数十年依旧能够保持病理分析的完整性。FFPE组织是一种十分经济的存档形式，因此在各医院及组织数据库中被普遍使用。FFPE样本为研究疾病的分子机制、疾病潜在生物标志物研究以及发现新的药物靶标提供了宝贵的样本资源库。FFPE标本病种繁多，数量巨大，到目前为止预计有上亿数量的各类疾病的FFPE组织样本被保存，其中蕴含了大量的临床数据，包括组织学报告、治疗结果和患者预后情况等。这些临床数据作为重要的回顾性诊断分析资源可用于疾病标志物的发现、表型的区分以及疾病的分子分型，如何将这些珍贵的样本转化为数字化资源是临床蛋白质组学近几年来研究的重点和热点。从2005年hood等人第一次利用FFPE组织样本进行蛋白质组学研究开始，陆续有应用FFPE组织样本进行蛋白质组学的研究报道，近几年应用FFPE组织样本开展临床蛋白质组学研究更是取得了突飞猛进的发展：2018年通过临床卵巢癌FFPE样本多维度蛋白组学研究发现并确定CT45是卵巢癌的化疗敏感性介质和免疫治疗靶点,2020年子宫内膜癌FFPE蛋白组学研究发现他莫昔芬暴露患者中Stathmin(STMN1，又名Oncoprotein 18)是子宫内膜癌的潜在标志物等，这些高水平的临床FFPE蛋白质组学研究为各类疾病的治疗靶标筛选、疾病诊断标志物的发现以及疾病分子分型等提供了重量级的科学依据。目前应用非标记定量蛋白质组学方法对FFPE组织样本进行高分辨质谱分析，单针质谱运行可提供2000
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5000个蛋白质的定量信息，非常适合临床大队列FFPE组织样本分析。
[0003]FFPE样本制作过程中由于组织经过石蜡包埋，常规处理需要去除石蜡避免后续干扰质谱分析；另外由于甲醛的使用导致组织细胞中的蛋白质发生交联，固定时间越长蛋白质发生交联程度越大。这种交联反应使FFPE组织内蛋白质的检测和鉴定变得困难，因为交联限制了蛋白的提取效率，并可能导致质蛋白发生额外修饰并最终影响质谱鉴定，很长一段时间以来研究人员认为FFPE组织样本并不适合进入质谱分析。因此对微量FFPE组织开展科学研究存在着很大的技术壁垒，科学家们尝试改进各种实验条件进行蛋白提取，有研究用高温高压法进行蛋白提取，取得较好的实验结果。常规的蛋白质组学分析过程十分繁琐且需要不断更换实验容器，样品损失较大，微量样品很容易在处理过程中损失殆尽，无法进行后续研究；另外FFPE组织中蛋白的交联状态极大地影响蛋白的提取效率。目前常用的微量FFPE组织前处理方法包括：SP3方法(single
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pot solid
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phase
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enhanced sample preparationprotocol,SP3)灵敏度高，非常适合微量样品的前处理，该方法对实验操作具有较高的要求，且成本高昂，适合实验室科研层面的操作，对于临床高通量的样本量而言并
不具备足够的成本优势；再如iST(in
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StageTip)技术，iST微量样品处理试剂盒同样能够对1
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100ug的微量样品进行处理，然而对单个肾小球或者更小的FFPE组织样品不一定适用，且试剂盒费用较高。
技术实现思路
[0004]针对现有蛋白质组学分析技术存在的不足以及临床上对微量的FFPE样本进行研究与应用的迫切需求，本专利技术提供了微量FFPE样本的高效前处理方法及质谱分析策略，微量FFPE切片样品无需去除石蜡，不需要文献报道的高温高压条件，无需进行样品转移，一次性完成所有的蛋白质组学前处理步骤，再通过direct
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DIA(数据非依赖采集模式，data independent analysis，DIA)质谱数据采集模式对其进行分析，实现对微量FFPE样本蛋白质组学的高效处理与深度、精确分析。
[0005]为了实现上述专利技术目的，本专利技术技术方案如下：
[0006]第一方面，本专利技术提供一种微量福尔马林固定石蜡包埋(FFPE)组织样本的高效前处理方法，所述方法具体包括以下步骤：
[0007]1)取临床微量穿刺FFPE组织切片样品，显微镜下观察并拍照，然后使用刮刀将样品刮至EP管内；
[0008]2)样品中加入高效蛋白裂解液(溶液成分：20mM Tris HCl，4％SDS,200mM DTT,20％glycerol,1％protease,pH 8.0)，恒温金属浴加热，充分提取蛋白并进行蛋白的解交联；
[0009]3)蛋白提取结束后加入碘乙酰胺(IAA)溶液进行烷基化反应，避光反应；
[0010]4)反应结束后加入预冷丙酮，放置在冰箱过夜，第二天进行丙酮清洗，然后将蛋白沉淀在通风柜内吹干；
[0011]5)加入测序级胰蛋白酶，放在恒温震荡仪上，400rpm，37℃过夜(12～18小时)；
[0012]6)酶解反应结束后将上清溶液全部蒸干，使用C18柱除盐，将除盐后的洗脱液全部蒸干，用质谱进样溶液复溶，离心，即可进入质谱分析。
[0013]进一步地，步骤1中所述的FFPE样品选自临床肾穿刺FFPE切片样本。
[0014]进一步地，步骤2中所述的高效蛋白裂解液的加入量为20～40ul，所述的恒温金属浴加热的时间为1
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2小时，恒温金属浴加热的温度为80～100℃。
[0015]进一步地，步骤3中所述的避光反应的时间为30～45分钟。
[0016]进一步地，步骤4中所述的加入预冷丙酮的体积为3～5倍步骤3反应液的体积。
[0017]进一步地，步骤5中所述的胰蛋白酶加入量为0.5～1μg。
[0018]进一步地，步骤6中所述的离心过程为10000～12000
×
g离心10～15分钟。
[0019]进一步地，所述的前处理方法具体包括以下步骤：
[0020]1)取临床微量肾穿刺FFPE样品，使用显微镜观察微量切片上肾小球的数量，然后将样品刮至EP管内；
[0021]2)样品中加入20～40μl高效蛋白裂解液(溶液成分：20mM Tris HCl，4％SDS，200mM DTT，20％glycerol，1％protease，pH 8.0)，恒温金属浴100℃加热1～2小时，充分提取蛋白并进行蛋白的解交联；
[0022]3)蛋白提取结束后加入1M碘乙酰胺(IAA)溶液进行烷基化反应，IAA终浓度为
55mM，避光反应30～45分钟；
[0023]4)反应结束后加入3～5倍体积的预本文档来自技高网...
【技术保护点】
【技术特征摘要】
1.一种微量FFPE组织样本的高效前处理方法，其特征在于，所述方法具体包括以下步骤：1)取临床微量FFPE组织切片样品，显微镜下观察并拍照，然后使用刮刀将样品刮至EP管内；2)样品中加入高效蛋白裂解液(溶液成分：20mMTrisHCl，4％SDS,200mM DTT,20％glycerol,1％protease,pH8.0)，恒温金属浴加热，充分提取蛋白并进行蛋白的解交联；3)蛋白提取结束后加入碘乙酰胺(IAA)溶液进行烷基化反应，避光反应；4)反应结束后加入预冷丙酮，放置在冰箱过夜，第二天进行丙酮清洗，然后将蛋白沉淀在通风柜内吹干；5)加入测序级胰蛋白酶，放在恒温震荡仪上，400rpm，37℃过夜(12～18小时)；6)酶解反应结束后将上清溶液全部蒸干，使用C18柱除盐，将除盐后的洗脱液全部蒸干，用质谱进样溶液复溶，离心，即可上样进入质谱分析。2.如权利要求1所述的前处理方法，其特征在于，步骤2中所述的高效蛋白裂解液的加入量为20～40ul，所述的恒温金属浴加热的时间为1～2小时，恒温金属浴加热的温度为80～100℃。3.如权利要求1所述的前处理方法，其特征在于，步骤3中所述的避光反应的时间为30～45分钟；步骤4中所述的加入预冷丙酮的体积为步骤3反应液的体积的3～5倍。4.如权利要求1所述的前处理方法，其特征在于，步骤5中所述的胰蛋白酶加入量为0.5～1μg。5.如权利要求1所述的前处理方法，其特征在于，步骤6中所述的离心过程为10000～12000
×
g离心10～15分钟。6.一种微量福尔马林固定石蜡包埋(FFPE)组织的蛋白质组学MicroAP
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dDIA分析方法，其特征在于，具体方法包括：1)前处理得到的肽段溶液通过用纳升级液相色谱仪进行色谱分离：将前处理后的待测样品加载到分析柱上，C18填料，控制柱流速与柱温，流动...
【专利技术属性】
技术研发人员：孟丽媛，潘晓霞，夏雯雯，周立，夏立，孟爽，
申请(专利权)人：上海交通大学医学院，
类型：发明
国别省市：
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