一种减少气溶胶污染的重组Bst-UNG酶及其编码基因制造技术

本发明专利技术实施例公开了一种减少气溶胶污染的重组Bst

【技术实现步骤摘要】
一种减少气溶胶污染的重组Bst
‑
UNG酶及其编码基因


[0001]本专利技术实施例涉及生物
，具体涉及一种减少气溶胶污染的重组Bst
‑
UNG酶及其编码基因。

技术介绍

[0002]环介导等温扩增(loop
‑
mediated isothermal amplification，LAMP)是Notomi等人于2000年提出来的一种新的核酸扩增技术，已被广泛地应用于病原微生物检测和传染性疾病诊断等领域。反应原理为，当FIP的F2区与靶DNA的F2c区结合并启动互补链合成时，扩增开始，然后F3引物结合到靶DNA的F3c区并延伸，置换FIP连接的互补链。这条互补的链在5'端形成一个环作为BIP的模板。B2结合到到模板DNA的B2c区域。DNA合成开始形成互补链并打开5'端环。随后，B3结合到靶DNA的B3c区域并延伸，取代BIP连接的互补链。这样会形成一个哑铃状DNA。核苷酸通过BstDNA聚合酶添加到F1的3'端，其延伸并打开5'端的环。哑铃形状的DNA现在被转化为茎环结构，该结构用作LAMP循环的引发剂，开始LAMP反应的第二阶段，用于LAMP的指数扩增。获得的最终产物是具有不同茎长度的茎环DNA和具有多个环的各种花头菜样结构的混合物。
[0003]由于LAMP反应自身灵敏度较高，容易受到气溶胶的污染，出现检测假阳性。鉴于此，特提出本专利技术。

技术实现思路

[0004]为此，本专利技术实施例提供一种减少气溶胶污染的重组Bst
‑
UNG酶。Cod UNG酶能够选择性水解双链或单链DNA中尿嘧啶与脱氧核糖之间的N
‑
糖苷键，形成缺失一个碱基位点(无嘧啶)的DNA链，在碱性溶液及高温条件下会进一步水解断裂，从而被完全水解；且Cod UNG酶对RNA中的尿嘧啶无活性。本专利技术将Bst DNA聚合酶和UNG酶进行融合，一次性加入表达的酶可以减少加入试剂的次数，从而减少气溶胶污染。
[0005]为了实现上述目的，本专利技术实施例提供如下技术方案：
[0006]根据本专利技术实施例的第一方面，提供一种编码减少气溶胶污染的重组Bst
‑
UNG酶的基因，所述基因的核苷酸序列包括：
[0007]用于编码Bst DNAPOLⅠ蛋白的如SEQ ID NO:1所示的核苷酸序列；和，
[0008]用于编码Cod UNG蛋白的如SEQ ID NO:2所示的核苷酸序列。
[0009]Bst DNA聚合酶大片段(Bst DNA POLⅠ)是Bacillus stearothermophilus DNA聚合酶的一部分，来源于E.coli菌株，利用基因重组技术，在大肠杆菌中进行表达后经多次纯化分离而得，该酶具有5'
→
3'DNA聚合酶活性，但不具有5'
→
3'外切核酸酶活性。专利技术人发现，将Bst DNAPOLⅠ核苷酸序列中51A>C(SEQ ID NO:1)，能够增加Bst DNAPOLⅠ5'
→
3'DNA聚合酶活性，提高扩增效率，缩短反应时间，最大程度减少气溶胶污染。
[0010]进一步地，所述SEQ ID NO:1所示的核苷酸序列和SEQ ID NO:2所示的核苷酸序列通过柔性linker融合连接，所述柔性linker的核苷酸序列为：
GGCGGCGGCGGCAGCGGCGGCGGCGGCTCG。
[0011]根据本专利技术实施例的第二方面，提供一种减少气溶胶污染的重组Bst
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UNG酶，所述重组Bst
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UNG酶由如上所述的基因编码得到。
[0012]根据本专利技术实施例的第三方面，提供一种表达载体，所述表达载体含有如上所述的基因。
[0013]根据本专利技术实施例的第四方面，提供一种宿主细胞，所述宿主细胞含有如上所述的基因，或如上所述的表达载体。
[0014]根据本专利技术实施例的第五方面，提供如上所述的基因、如上所述的重组Bst
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UNG酶、如上所述的表达载体，或如上所述的宿主细胞在环介导等温扩增中的应用。
[0015]本专利技术实施例具有如下优点：
[0016]本专利技术提供的重组BSt
‑
UNG酶可以很好的扩增LAMP反应，能有效增加聚合酶的扩增效率，与此同时，一次性加入表达的酶可以减少添加试剂的次数，减少长时间开盖引起的气溶胶污染可能性，最大程度防止气溶胶污染。
附图说明
[0017]为了更清楚地说明本专利技术的实施方式或现有技术中的技术方案，下面将对实施方式或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍。显而易见地，下面描述中的附图仅仅是示例性的，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据提供的附图引伸获得其它的实施附图。
[0018]图1为本专利技术提供的Bst聚合酶和重组Bst
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UNG酶的SDS
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PAGE电泳检测结果；
[0019]图2为本专利技术提供的重组Bst
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UNG体系检测结果；
[0020]图3为本专利技术提供的扩增效率凝胶电泳检测结果。
具体实施方式
[0021]以下由特定的具体实施例说明本专利技术的实施方式，熟悉此技术的人士可由本说明书所揭露的内容轻易地了解本专利技术的其他优点及功效，显然，所描述的实施例是本专利技术一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本专利技术中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本专利技术保护的范围。
[0022]实施例1
[0023]本实施例提供一种编码减少气溶胶污染的重组Bst
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UNG酶的基因序列由如SEQ ID NO:1所示的核苷酸序列、柔性linker、如SEQ ID NO:2所示的核苷酸序列通过串联的方式依次连接，其中柔性linker的核苷酸序列为：GGCGGCGGCGGCAGCGGCGGCGGCGGCTCG(SEQ ID NO:3)。
[0024]编码重组Bst
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UNG酶的基因序列由上海生工生物股份有限公司合成。
[0025]实施例2
[0026]本实施例提供重组Bst
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UNG酶的制备
[0027]1.将质粒化转至BL21感受态中。
[0028]a)转化方式为热激转化：将合成好的质粒干粉用50μL无菌水进行稀释，稀释后取1～2μL加入至BL21感受态中；
[0029]b)冰浴30min，42℃水浴90s，冰浴3min，加500μL无抗LB培养基，37℃孵育30min，涂平板。
[0030]2.摇瓶发酵：挑取单克隆于20mL LB(1％(W/V)Tryptone，0.5％(W/V)Yeast Extract，1％(W/V)NaCl)培养基中37℃过夜培养37℃，180RPM，转接至200mL LB培养基中进行扩大培本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种编码减少气溶胶污染的重组Bst
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UNG酶的基因，其特征在于，所述基因的核苷酸序列包括：用于编码BstDNAPOLⅠ蛋白的如SEQ ID NO:1所示的核苷酸序列；和，用于编码CodUNG蛋白的如SEQ ID NO:2所示的核苷酸序列。2.根据权利要求1所述的编码减少气溶胶污染的重组Bst
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UNG酶的基因，其特征在于，所述SEQ ID NO:1所示的核苷酸序列和SEQ ID NO:2所示的核苷酸序列通过柔性linker融合连接，所述柔性linker的核苷酸序列为：GGCGGCGGCGGCAGCGGC...

【专利技术属性】
技术研发人员：郝立颖，彭勇，韩豪杰，
申请(专利权)人：北京世纪沃德生物科技有限公司，
类型：发明
国别省市：