抗菌多肽和应用以及细菌生长抑制剂、抗感染药物或保健品制造技术

本发明专利技术涉及一种源于大曲的具有对以大肠杆菌和金黄色葡萄球菌为代表的革兰氏阴性菌和革兰氏阳性菌有抑制活性的多肽。其氨基酸序列为Asp

【技术实现步骤摘要】
抗菌多肽和应用以及细菌生长抑制剂、抗感染药物或保健品


[0001]本专利技术涉及一种来源于大曲的抗菌多肽DGKAPGMIGWMPEKTVTFI及其在制备细菌生长抑制剂、抗感染药物和/或保健品中的应用。

技术介绍

[0002]抗生素是一种由微生物所产生的特殊的次生代谢有机物，低浓度使用时即可通过阻碍细菌的核酸形成、抑制细菌蛋白质合成、改变细菌的细胞膜通透性以及干扰细菌细胞壁的合成等方式对细菌的生长和代谢起抑制作用。抗生素由于其显著的抗菌效果被广泛应用，然而过度使用也导致了细菌耐药性的产生，使得细菌感染性疾病的的治疗愈发困难。
[0003]抗菌肽(antimicrobial peptides,AMPs)作为一种新型的抗生素，来源非常广泛，具有10
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50个氨基酸，强阳离子性，两亲性，以及广谱抑菌性等特点。相比于传统的抗生素，抗菌肽的最大优势为：抗菌肽主要是通过静电引力结合到细菌细胞膜上，凭借疏水作用与磷脂结合插入细胞质膜，使细菌细胞膜结构破坏。这种外力作用基本不会使微生物产生耐药性。然而，目前抗菌肽的应用仍然面临着两大难题：首先是天然抗菌肽的抗菌活性相对较低，其次是抗菌肽的稳定性、细胞毒性难以调控。因此。开发安全、稳定、低细胞毒性的抗菌肽具有重要意义。
[0004]大曲是微生物以谷物为底物高温发酵而成，其中源于谷物蛋白的抗菌肽是食源性的，天然安全，作为抗菌药物具有良好的潜质。因此，本专利技术从大曲中筛选出一种源于大曲底物小麦蛋白的抗菌肽，可以作为一种制备预防和/或降低由大肠杆菌和金黄色葡萄球菌引起的肠道感染疾病的药物和/或保健品进行研究。

技术实现思路

[0005]本专利技术的目的是提供一种源于大曲底物小麦蛋白的抗菌多肽DGKAPGMIGWMPEKTVTFI在制备预防和/或降低由大肠杆菌和金黄色葡萄球菌引起的肠道感染疾病的药物和/或保健品中的应用。
[0006]为实现上述目的，本专利技术以所述多肽DGKAPGMIGWMPEKTVTFI为抑制微生物生长活性的有效成份。
[0007]其具有序列表SEQ ID NO：1中氨基酸序列，多肽DGKAPGMIGWMPEKTVTFI为抗大肠杆菌和金黄色葡萄球菌药物的活性成份，其中可添加药物学上可接受的载体或辅料。
[0008]具有对大肠杆菌和金黄色葡萄球菌抑制活性的多肽化合物DGKAPGMIGWMPEKTVTFI，氨基酸序列为Asp
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Gly
‑
Lys
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Ala
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Pro
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Gly
‑
Met
‑
Ile
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Gly
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Trp
‑
Met
‑
Pro
‑
Glu
‑
Lys
‑
Thr
‑
Val
‑
Thr
‑
Phe
‑
Ile。分子量2078.47Da，白色粉末状，易溶于水，对大肠杆菌和金黄色葡萄球菌的生长具有很强的抑制作用。
[0009]本专利技术与现有技术相比，具有如下有益效果：
[0010]本专利技术从大曲中获得并确定了上述多肽的结构，首次验证了上述多肽具有较好的抑菌活性，在制备预防和/或降低由大肠杆菌和金黄色葡萄球菌引起的肠道感染疾病的药
物和/或保健品方面具有良好的应用前景。
附图说明
[0011]图1为多肽DGKAPGMIGWMPEKTVTFI的抑菌结果图，其中图1(A)为多肽DGKAPGMIGWMPEKTVTFI抑制大肠杆菌的实验结果图；图1(B)为多肽DGKAPGMIGWMPEKTVTFI抑制金黄色葡萄球菌的实验结果图。
具体实施方式
[0012]实施例1多肽DGKAPGMIGWMPEKTVTFI的制备及鉴定
[0013]采用LC
‑
MS/MS与bottom
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up蛋白质组学技术相结合的方法。以市售酱香型高温大曲(RH
‑
02，泸州瑞华生物制曲有限公司)为原料，经过水和乙醇的梯度提取，离心，超滤及LC
‑
MS/MS分析，结合构效关系特征，筛选对大肠杆菌和金黄色葡萄球菌具有抑制作用的肽段。
[0014]其具体方法如下：
[0015](1)样品制备
[0016]1g大曲样品与20mL超纯水混合，37℃，200rpm振荡2h，4℃、15000
×
g转速下离心15min，取出上清液(记为上清液A)，沉淀(记为沉淀A)加入20mL 50％的乙醇
‑
水溶液，37℃，200rpm振荡2h，4℃、15000
×
g转速下离心15min，取出上清液(记为上清液B)，沉淀(记为沉淀B)加入20mL乙醇，37℃，200rpm振荡2h，4℃、15000
×
g转速下离心15min，取出上清液(记为上清液C)。上清液A、B、C分别用截留分子量为10000Da的超滤膜超滤，获得的相应滤液A、B、C分别用C18
‑
SPE柱(Waters Oasis HLBSPE)除盐。除盐后将样品冻干，
‑
80℃保存，获得相应的冻干保存的样品A、B、C。
[0017](2)LC
‑
MS/MS分析
[0018]冻干保存的样品A、B、C分别复溶于0.1％(v/v)FA
‑
H2O溶液中，LTQ
‑
Orbitrap Velos(双分压线性阱和静电场轨道阱组合式高分辨质谱)对样品进行质谱分析。上样量分别为2μg，液相色谱的流动相A为含0.1％甲酸的水溶液(v/v)，流动相B为含0.1％甲酸的乙腈(v/v)。梯度洗脱程序如下：
[0019]0‑
80min，7％
‑
27％B(v/v)；80
‑
95min，27％
‑
40％B；95
‑
97min，40％
‑
90％B；97
‑
107min，90％B；107
‑
109min，90％
‑
0％B；109
‑
126min，0％B，流速60μL/min
[0020]质谱离子源为ESI，离子传输温度250℃，喷雾电压2.2kV，归一化碰撞能量35％，一级谱分辨率60000，扫描范围400
‑
2000m/z，数据采集模式为数据依赖模式(DDA)。选取一级谱中20个最强的母离子进行二级碎裂，动态排除设置为:重复计数，2；重复时间,30s；排除时间为60秒。
[0021](3)数据检索
[0022]RAW文件使用MaxQuant
TM
(v.1.5.3.30)软件在小麦(wheat，379个蛋白)数据库(http://ww本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种抗菌多肽，其特征在于：所述多肽为DGKAPGMIGWMPEKTVTFI，具有序列表SEQ ID NO：1中氨基酸序列；该多肽的氨基酸序列具体为Asp
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Gly
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Lys
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Ala
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Pro
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Gly
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Met
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Ile
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Gly
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Trp
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Met
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Pro
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Glu
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Lys
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Thr
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Val
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Thr
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Phe
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Ile。2.一种权利要求1所述多肽在制备大肠杆菌和/...

【专利技术属性】
技术研发人员：靳艳，于洋，于文皓，
申请(专利权)人：中国科学院大连化学物理研究所，
类型：发明
国别省市：