一种潜伏性结核病ELISA诊断试剂盒制造技术

本发明专利技术属于生物医学技术领域，具体涉及一种检测潜伏性结核病感染的试剂盒及其制备方法。本发明专利技术基于在结核杆菌体内发现RV1737c多肽片段的研究，利用该抗原与自身抗体结合后通过一系列免疫反应最终释放大量的IFN

【技术实现步骤摘要】
一种潜伏性结核病ELISA诊断试剂盒


[0001]本专利技术属于生物医学
，具体涉及一种检测潜伏性结核病感染的试剂盒及其制备方法。本专利技术还涉及利用间接ELISA方法
‑‑
利用酶标记的抗抗体以检测与固相抗原结合的受检抗体的原理，从而发现了并验证了Rv1737c多肽抗原片段在潜伏性结核病方面的诊断价值并通过制作潜伏性结核病ELISA试剂盒对结核病进行。
[0002]
技术介绍

[0003]结核病（TB，Tuberculosis）是一个从古至今严重威胁人类健康的疾病和重大公共卫生问题，主要由结核分枝杆菌（MTB，Mycobacterium）引起。通过2018年调查数据来看，全球新发结核病患者约1000万，在这其中仅中国结核病新发患者就约为86.6万。而肺外结核感染十分的隐匿，潜伏期结核感染同样也是缺乏特异性的临床表现，对于患者的诊断治疗都有较大困难。虽然随着我国结核病防治工作的推进，结核病的发病率正在下降，但我国仍是结核病高负担国家，对于结核病的诊断防控依然艰巨。
[0004]现在常用的检测方式有：抗酸染色后结核分枝菌痰涂片找菌、结核菌素皮肤试验（TST）、血清结核抗体的检测、结核分枝杆菌核酸的检测等，都为近年来发展的基于细胞免疫学的方法，但这些检测方法的特异性和灵敏度有限。干扰素释放实验（interferon
‑
release assays，IGRAs）在结核感染诊断时特异性和灵敏度较好，但是IGRAs实验不能检测感染状态，不能对潜伏及活动期有所区分。因此从学术角度来看，目前潜伏性结核病的诊断技术和方法仍为基础医学的重难点；从商业角度来看，潜伏性结核病诊断相关产品的市场仍为空白。
[0005]潜伏结核感染（LTBI）是指结核分枝杆菌刺激后机体处于持续性免疫状态，临床无活动性结核的证据，也无特异性影像学诊断与血清标志物。潜伏结核感染患者为结核病高危人群且需要进行预防性的干预。Rv1737c抗原是Voskuil等利用基因芯片技术发现在RD区中48个与缺氧相关的潜伏感染抗原之一，与活动性结核患者相比，该抗原更易被结核分枝杆菌潜伏感染人群外周血中的淋巴细胞识别。有生物信息学研究分析,Rv1737c蛋白用BIMAS量化基序法及NetCTL等预测CTL表位，Th表位数目多分值较高，是一种较好的T细胞抗原,即可能成为细胞免疫功能多肽候选抗原。Rv1737c在结核杆菌感染后体内的IgG，IgA，IgM特异性抗体均较感染前升高，细胞因子IFN
‐
γ，IL
‐
10，IL
‐
6等释放水平升高且差异明显，有作为潜伏性感染抗原的意义。由于相关蛋白有感染的风险，天然含量低，结核菌的生长周期长，从实用性、安全性等考虑，不直接从菌体提取，而选取亲和力强、抗原性高的序列做为新抗原，以评估对结核病早期的诊断价值。利用Rv1737c抗原与抗体结合的高特异性和高灵敏度特点，并用于潜伏性结核病的诊断，有利于控制疾病的发生发展。

技术实现思路

[0006]针对现有技术中存在的问题，本专利技术发现Rv1737c多肽抗原片段能够成为一种检
测潜伏性结核病的新抗原，并且提供一种利用间接ELISA法检测潜伏性结核病的试剂盒及其制备方法和应用。
[0007]本专利技术所述的多肽抗原Rv1737c基因序列是来自于美国国立生物技术信息中心DNA数据库NCBIGenBank(www.ncbi.nlm.nih.gov/genbank/)中获取Mycobacterium tuberculosis H37Rv全基因组信息，结核杆菌国际标准株H37Rv(Mycobacterium tuberculosis H37Rv)基因序列(登录号：215382.1)。Rv1737c基因编码蛋白序列：NC_000962.3：M1964183
‑
1965370 ycobacterium tuberculosis H37Rv。
[0008]多肽抗原片段Rv1737c由上海强耀生物科技有限公司合成，包被肽段工作浓度为0.5ug/ml。
[0009]本专利技术对目的蛋白进行临床性试验检测，得出其特征在于蛋白多肽抗原Rv1737c与维持潜伏性结核病状态相关，在潜伏性结核病感染者中有较高水平免疫反应，因此其可以作为检测潜伏性结核病的新抗原。
[0010]本专利技术所述检测的方法为ELISA法。
[0011]进一步地，所述检测的方法为间接ELISA法。
[0012]更进一步地，本专利技术通过血清学反应原理，运用间接ELISA法制作潜伏性结核病诊断试剂盒。
[0013]上述检测方法包括以下步骤：S1、以结核杆菌的Rv1737c多肽片段为包被抗原用包被液包被酶标板,并封闭微孔表面未吸附位点；S2、将待测人血清稀释后加入酶标板的孔中,同时设置空白对照孔、阴性对照孔和阳性对照孔,待测人血清中的抗体与酶标板中的包被抗原进行反应,洗去反应后未结合的物质；S3、加入酶标二抗（HRP 标记羊抗人IgG）反应,洗去反应后未结合的酶标二抗,然后加入底物显色液进行显色后，用终止液终止反应,根据测得的0D
450
值，计算阴阳性临界值；S4、当阴阳性临界值≥2.1时,则待测人血清为潜伏性结核病抗原阳性;当阴阳性临界值＜2.1,则待测人血清为潜伏性结核病抗原阴性。
[0014]所述阴阳性临界值的计算公式为：阴阳性临界值=(待检样品的平均0D
450
值
‑
阴性对照平均0D
450
值)/(阳性对照平均OD
450
值
‑
阴性对照平均0D
450
值）优选地，步骤S1所述包被液为PH9.6 的碳酸盐包被液。
[0015]优选地，步骤S1所述人全血包被的浓度为0.5μg/mL。
[0016]优选地，步骤S1所述包被的条件为4℃包被过夜。
[0017]优选地，步骤S1所述包被抗原包被酶标板的条件为4℃包被过夜。
[0018]优选地，步骤S2所述稀释的倍数为150倍。
[0019]优选地，步骤S2所述反应的条件为37℃反应2h。
[0020]优选地，步骤S3所述酶标二抗反应条件为37℃反应45min。
[0021]优选地，步骤S1所述封闭的条件为37℃封闭2h。
[0022]优选地，步骤S3所述酶标二抗稀释倍数为15000倍。
[0023]本专利技术的组成包括说明书、密封袋、酶标板、酶标记物、包被液、阴性和阳性对照血清、血清样品稀释液、20倍浓缩洗涤液、显色液、终止液。
[0024]（1）酶标板：酶标板孔内包被有Rv1737c蛋白多肽抗原，所述Rv1737c肽段由上海强耀有限公司合成，序列为IGPLSTSYARDMSLS，包被肽段工作浓度为0.5ug/ml，封闭微孔表面未吸附位点；（2)酶标记物：羊抗人IgG 抗体1:5000，1:10000和1：15000三种浓度稀释；（3)包被液：PH9.6的碳酸盐本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种潜伏性结核病间接ELISA诊断试剂盒，其特征在于，抗体检测板上包被的抗原为结核分枝杆菌目的片段Rv1737c多肽。2.根据权利要求1对目的蛋白进行临床性试验检测，得出其特征在于Rv1737c该段多肽抗原与维持潜伏性结核病状态相关，在潜伏性结核病感染者中具有较高水平免疫反应，因此可以作为检测潜伏性结核病的新抗原。3.根据权利要求2所述的血清学反应原理，运用间接ELISA法制作潜伏性结核病诊断试剂盒；试剂盒的组成包括说明书、密封袋、包被抗原的检测板、阴性和阳性对照血清、抗结核杆菌IgG结合物、20倍浓缩洗涤液、血清稀释板、终止液、样品稀释液、显色液；（1)酶标板：酶标板孔内包被有Rv1737c蛋白多肽抗原，所述Rv1737c肽段由上海强耀有限公司合成；包被肽段工作浓度为0.5ug/ml，封闭微孔表面未吸附位点；（2)酶标记物：羊抗人IgG 抗体1:5000、1:10000和1:15000三种浓度稀释；（3)包被液：PH9.6 的碳酸盐包被液；（3)阳性对照血清：确诊潜伏性结核病患者血清，并以血清稀释液按1:50,1:100，1:150 和1:200 稀释；（4)阴性对照血清：健康对照组人群血清，并以血清稀释液按 1:50,1:100，1:150 和1:200 稀释；（5)血清样品稀释液：PBS (0.01M, pH 7.4)；（6)20倍浓缩洗涤液：8g NaC1, 3g Na2HP04•
12H20, 0.6mLTween
‑
20,加蒸馏水至50mL；...

【专利技术属性】
技术研发人员：吴江东，杜威，朱丽，蒲阳媚，
申请(专利权)人：石河子大学，
类型：发明
国别省市：