使用化学修饰的引导RNA的高特异性基因组编辑制造技术

本发明专利技术涉及具有化学修饰的引导RNA及其在CRISPR

【技术实现步骤摘要】
使用化学修饰的引导RNA的高特异性基因组编辑
[0001]本申请是2017年6月8日提交的申请号为201780049055.3、专利技术名称为“使用化学修饰的引导RNA的高特异性基因组编辑”的专利技术专利申请的分案申请。
专利

[0002]本专利技术涉及分子生物学领域。具体而言，本专利技术涉及成簇规律间隔短回文重复序列(CRISPR)技术。专利技术背景
[0003]天然的原核CRISPR
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Cas系统包括一系列具有恒定长度的介入可变序列的短重复序列(即，成簇规律间隔短回文重复序列序列或“CRISPR”)以及CRISPR相关(“Cas”)蛋白。转录的CRISPR系列的RNA被一部分Cas蛋白加工成小的引导RNA，引导RNA通常具有两个组分，如下文所述的。至少存在六种不同的系统：I型、II型、III型、IV型、V型和VI型。将RNA加工为成熟crRNA的过程中涉及的酶在这六种系统中是不同的。在天然原核II型系统中，引导RNA(“gRNA”)包括两种短的非编码RNA，称为CRISPR RNA(“crRNA”)和反式作用RNA(“tracrRNA”)。在一个示例性的系统中，gRNA与Cas核酸酶形成复合物。gRNA：Cas核酸酶复合物结合具有原型间隔序列毗邻基序(“PAM”)和原型间隔序列(protospacer)的靶多核苷酸序列，原型间隔序列是与gRNA的一部分互补的序列。gRNA：Cas核酸酶复合物通过识别和结合靶多核苷酸而诱导靶多核苷酸的切割。天然CRISPR
‑
Cas系统作为原核生物中的免疫系统而发挥功能，其中gRNA：Cas核酸酶复合物以类似于真核生物中的RNAi的方式识别外源遗传元件并使其沉默，由此赋予对外源遗传元件(如质粒和噬菌体)的抗性。
[0004]已经证明，单引导RNA(“sgRNA”)，其中crRNA和tracrRNA共价连接，可以代替天然存在的crRNA与tracrRNA之间形成的复合物。
[0005]与开发gRNA(包括sgRNA)相关的考虑因素包括特异性、稳定性和功能性。特异性是指特定的gRNA：Cas核酸酶复合物结合、切刻和/或切割期望的靶标序列、而较少发生或不发生结合、切刻和/或切割在序列和/或位置上不同于期望的靶标的多核苷酸的能力。因此，特异性是指将gRNA：Cas核酸酶复合物的脱靶效应最小化。需要提供这样的gRNA(包括sgRNA)，其具有期望的对靶多核苷酸的结合亲和力，同时具有降低的脱靶效应，但仍然具有期望的gRNA功能性。还需要更好的途径来制造和使用具有增强的特异性、同时具有期望的对靶多核苷酸的结合亲和力和/或降低的脱靶结合的gRNA(包括sgRNA)。附图简述
[0006]图1是示例性CRISPR
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Cas系统的说明。复合物由单引导RNA和Cas蛋白形成，并且所述复合物识别并结合靶多核苷酸。该Cas核酸酶是酿脓链球菌Cas9核酸酶。酿脓链球菌Cas9核酸酶识别PAM序列(此处，PAM序列是3核苷酸序列NGG，其中N是A、G、C或T，但已知存在其他的PAM序列，如NAG等)。sgRNA包括引导序列、crRNA序列或区段、以及tracrRNA序列或区段。sgRNA的引导序列与DNA靶标的PAM序列的上游直接杂交。
[0007]图2A显示了包含crRNA区段203和tracrRNA区段205的示例性引导RNA 201。图2B显示了包含crRNA区段209和tracrRNA区段211的示例性单引导RNA 207，其中crRNA区段和
tracrRNA区段通过环213连接。
[0008]图3显示了可以包括在引导RNA中的各种化学修饰的一些的结构；当然，图3并不意图是限制性的，可以采用本文所述的许多其他修饰。
[0009]图4是显示当寡核苷酸双链体通过加热分离成单独的链时紫外光(UV)吸收如何增加的曲线图。S形曲线反映了双链体解离成分开的链，S形曲线的中心是双链体的T
m
。这个曲线指示在生理盐浓度下20个核苷酸的RNA/DNA双链体的解链温度约为50℃。
[0010]图5A展示了单引导RNA(sgRNA)或两片段双引导RNA(“dgRNA”)，后者中crRNA区段和tracrRNA区段形成杂交双链体，并显示了引导RNA的延伸区、锁定区、取样区、种子区(通常为10聚体)、双引导茎或单引导茎环、以及tracrRNA区。图5B展示了在引导序列的种子部分和互补DNA序列之间初始形成种子双链体之后，核苷酸的结合如何依次通过取样区和锁定区形成具有解链温度的RNA/DNA双链体。图5C展示了种子区核苷酸中的化学修饰可以降低各个碱基对的结合能，同时保持高水平的协同性，由此延伸取样区并降低RNA/DNA双链体的解链温度。图5C还展示了取样区中的化学修饰。
[0011]图6A展示了实验性crRNA多核苷酸，其具有20个核苷酸的引导序列并且通过在引导序列中的不同位置掺入各种类型的化学修饰而被修饰。图6B显示了包含未修饰的crRNA的RNA/DNA双链体的解链曲线。图6C至6F显示了包含化学修饰的crRNA的RNA/DNA双链体的解链曲线，所述crRNA在不同的引导序列中在核苷酸6至9处包含不同类型的修饰。
[0012]图7是显示与互补DNA链杂交的引导序列(在crRNA中)的20个碱基对的双链体，在引导序列渐进的5
′
截短或5
′
延伸(如x轴上负整数或正整数指示)之后，解链温度变化的图。
[0013]图8A显示了在靶向人CLTA基因中的“CLTA1”序列的gRNA中进行的化学修饰对靶多核苷酸的体外切割[称为“中靶”(“ON”)]的影响、以及另行测定的对两个不同的脱靶多核苷酸[称为“脱靶1”(“OFF1”)和“脱靶3”(“OFF3”)的]的切割的影响，分别表示CLTA1中靶(ON
‑
target)、CLTA1脱靶1
‑
靶(OFF1
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target)和CLTA1脱靶3
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靶(OFF3
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target)。
[0014]图8B是基于图8A中的切割结果，通过计算每个受测的合成sgRNA切割的靶多核苷酸与切割的脱靶多核苷酸的比值而导出的。还计算了将每个比值乘以每个测定的引导RNA的对应中靶切割百分比而获得的“特异性评分”。加阴影的比值和特异性评分的值比图8B中所示的其他值更大，值得注意。
[0015]图9A显示了在靶向人CLTA基因中的“CLTA4”序列的gRNA中不同位置处的2
′‑
O
‑
甲基
‑3′‑
PACE(“MP”)修饰对称为“中”(“ON”)的靶多核苷酸的体外切割的影响、以及另行测定的对称为“脱靶1”(“OFF1”)、“脱靶2”(“OFF2”)和“脱靶3”(“OFF3”)的三个不同的脱靶多核苷酸的切割的影响，分别表示为CLTA4中靶(ON
‑
target)、CLTA4脱靶1
‑
靶(OFF本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种合成的引导RNA，其包含：(a)crRNA区段，其包含(i)能够与靶多核苷酸杂交的引导序列，其中所述靶多核苷酸包含邻近PAM位点的靶序列，(ii)茎序列；和(b)tracrRNA区段，其包含与所述茎序列部分或完全互补的核苷酸序列，其中所述引导序列由20
‑
N个核苷酸组成，其中N是
‑
10至6之间的整数；其中所述引导序列进一步包含位于所述引导序列中从位置4
‑
N至20
‑
N的任何位置处的至少一个修饰。2.权利要求1的合成引导RNA，其中所述引导RNA是单引导RNA(sgRNA)。3.一种合成的crRNA，其包含能够与靶多核苷酸杂交的引导序列，所述靶多核苷酸包含邻近PAM位点的靶序列，其中所述引导序列由20
‑
N个核苷酸组成，其中N是
‑
10和6之间的整数；其中引导序列包括位于所述引导序列中从位置4
‑
N至20
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N的任何位置处的至少一个修饰。4.前述权利要求中任一项的合成的引导RNA或crRNA，其中所述至少一个修饰位于位置4
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N，5
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N，7
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N，9
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N，10
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N，11
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N，14
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N，或16
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N处。5.前述权利要求中任一项的合成的引导RNA或crRNA，其中所述至少一个修饰位于引导序列的位置5
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N或11

【专利技术属性】
技术研发人员：D，
申请(专利权)人：安捷伦科技有限公司，
类型：发明
国别省市：