【技术实现步骤摘要】
一种纯化蛋白的方法
[0001]本公开涉及蛋白纯化领域，具体涉及一种纯化蛋白(例如低等电点蛋白，例如低等电点抗体)的方法，特别是添加特定浓度及种类保护剂，有效避免缓冲体系跨越分子不稳定pH区间时样品不稳定的现象，并使用整合于蛋白纯化仪器的在线检测器实时监测流路中样品浑浊程度变化，及创新性的使用“阳离子交换层析流穿模式+阴离子交换层析结合洗脱模式”对工艺相关杂质进行有效去除。
技术介绍
[0002]随着生物医药的不断发展，抗体药物显示出越来越重要的地位。对含有目标抗体培养物进行分离纯化是其生产过程中必不可少的步骤，如何通过优化抗体的纯化条件，进一步增加去除杂质的效率，提高抗体的纯度和收率是目前工业化生产中重要的问题。
[0003]天然抗体分子等电点多数为pH 7.5～9.5，通常使用亲和层析、离子交换层析及疏水层析等技术手段，将抗体分子从培养液中分离及精纯。亲和层析填料配基可在近中性条件下特异性与抗体结合，在较低pH条件下与抗体分离。宿主细胞蛋白、宿主细胞核酸、亲和层析脱落的ProA配基等工艺相关杂质通常等电点较低，与抗体分子具有较大的电荷差异。通常使用阴离子交换层析流穿模式去除工艺相关杂质，即在特定条件下，抗体分子表面电荷以正电荷为主而直接流过层析柱，而工艺相关杂质表面电荷以负电荷为主进而吸附在层析柱上。通常使用阳离子交换层析对抗体分子进行精纯，即在特定条件下，工艺相关杂质表面电荷以负电荷为主直接流过层析柱，抗体分子表面电荷以正电荷为主吸附在层析柱上，然后通过提高缓冲体系离子强度或改变缓冲体系pH洗脱抗体分子...
【技术保护点】
【技术特征摘要】
1.一种纯化蛋白的方法，该方法包括以下步骤：a)亲和层析；b)流穿模式的阳离子交换层析；和c)结合洗脱模式的阴离子交换层析；所述蛋白是能被亲和层析的蛋白，优选抗体或含有抗体Fc的融合蛋白。2.根据权利要求1所述的方法，其中所述步骤a)亲和层析包括以下步骤：a
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1)上样：将包含蛋白的细胞培养澄清液加载到预处理的亲和层析填料上；a
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2)平衡：用平衡缓冲液清洗亲和层析填料；a
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3)预洗：用预洗缓冲液清洗亲和层析填料；a
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4)洗脱：用洗脱缓冲液洗脱，收集洗脱液，记为亲和层析洗脱产物；和/或，所述步骤b)流穿模式的阳离子交换层析包括以下步骤：b
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1)pH调节：将步骤a)的亲和层析洗脱产物的pH调节至高于蛋白等电点；b
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2)上样：将b
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1)pH调节后的亲和层析洗脱产物加载到预处理的阳离子交换层析填料上，收集流穿样品；b
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3)平衡：用平衡缓冲液清洗阳离子交换层析填料，收集冲洗样品；可选地，还进一步包含步骤b
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4)样品合并：将步骤b
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2)及步骤b
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3)所得样品合并，记为阳离子层析合并样品；和/或，所述步骤c)结合洗脱模式的阴离子交换层析包括以下步骤：c
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1)上样：将阳离子层析流穿样品或合并样品加载到预处理好的阴离子交换层析填料上；c
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2)平衡：用平衡缓冲液清洗阴离子交换层析填料；c
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3)洗脱：用洗脱缓冲液洗脱，收集洗脱液。3.根据前述任一项权利要求所述的方法，其中所述蛋白的等电点为约3.0至约10.0，优选约2.0至约6.5，更优选约5.7至约6.0。4.根据前述任一项权利要求所述的方法，其中所述步骤a)预洗缓冲液或洗脱缓冲液中还包括保护剂，所述保护剂选自氯化钠、醋酸钠、柠檬酸钠、精氨酸、精氨酸盐酸盐、组氨酸、组氨酸盐酸盐、赖氨酸、赖氨酸盐酸盐、天冬氨酸中的一种或多种；优选地，所述保护剂为精氨酸盐酸盐；优选地，所述保护剂的浓度为约1mM至约500mM，优选为约1mM至约100mM；和/或，所述步骤a)所用的亲和层析填料为MabSelect PrismA，和\或，步骤b)所用的阳离子交换层析填料为Eshmuno CPX；和\或，步骤c)所用的阴离子交换层析填料为Fractogel EMD TMAE。5.根据前述任一项权利要求所述的方法，其中所述步骤a)、b)或c)的平衡缓冲液、预洗缓冲液或洗脱缓冲液中的缓冲物质选自磷酸氢二钠
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磷酸二氢钠、Tris
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盐酸、Tris
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醋酸、磷酸氢二钠
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柠檬酸、醋酸
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醋酸钠中的一种或多种；优选地，所述缓冲物质的浓度为约10至约100mM。6.根据前述任一项权利要求所述的方法，其中：步骤a
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2)平衡缓冲液的pH为约7.0至约8.0，优选7.4；步骤a
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3)预洗缓冲液的pH为低于蛋白等电点约0.1至约2.5单位；和/或
步骤a
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4)洗脱缓冲液的pH为约3.0至约5.0，优选3.7。7.根据前述任一项权利要求所述的方法，其中所述步骤b
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1)样品调节中使用约0.01M至约100M Tris将亲和层析洗脱产物pH调节至高于蛋白等电点约0.1至约3.0单位，优选约1.0M Tris；和/或，所述步骤b
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3)平衡缓冲液中的缓冲物质pH与上样样品一致；优选地，所述步骤b
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1)样品调节中还进一步包括使用去离子水将样品稀释至电导率<5mS/cm，所述去离子水选自纯水、高纯水、超纯水。8.根据前述任一项权利要求所述的方法，其中所述步骤c
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3)洗脱缓冲液中还进一步包括氯化钠、精氨酸、精氨酸盐酸盐、组氨酸、组氨酸盐酸盐、甘氨酸中的一种或多种，优选氯化钠；优选地，所述氯化钠的浓度为约1至约1000mM，优选约100mM至约200mM。9.根据前述任一项权利要求所述的方法，其中：步骤c
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2)平衡缓冲液或洗脱缓冲液的pH高于蛋白等电点约0.1至约5.0单位，优选约0.5至约2.0单位；和/或步骤c
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3)洗脱缓冲液的电导率为约1至约50mS/cm，优选约18mS/cm至约50mS/cm、更优选约18mS/cm至约20mS/cm。10.根据前述任一项权利要求所述的方法，其中所述步骤a)、b)或c)的平衡缓冲液或预洗缓冲液冲洗1至10个柱体积，优选3至5个柱体积。11.一种纯化蛋白的方法，包括以下步骤：a)亲和层析a
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1)上样：将包含蛋白的细胞培养澄清液加载到预处理好的亲和层析填料上；a
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2)平衡：用平衡缓冲液清洗亲和层析填料；a
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3)预洗：用预洗缓冲液清洗亲和层析填料；a
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4)洗脱：用洗脱缓冲液洗脱，收集洗脱液；b)流穿模式的阳离子交换层析b
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1)样品调节：将亲和层析洗脱产物pH调节至高于蛋白等电点；b
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2)上样：将调节后的洗脱产物加载到预处理好的阳离子交换层析填料上，收集流穿样品；b
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3)平衡：用平衡缓冲液清洗阳离子交换层析填料，收集冲洗样品。可选地，还进一步包含步骤4)样品合并：将步骤2)及步骤3)所得样品合并，记为阳离子层析合并样品；c)结合洗脱模式的阴离子交换层析c
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1)上样：将阳离子层析流穿样品或合并样品加载到预处理好的阴离子交换层析填料上；c
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2)平衡：用平衡缓冲液清洗阴离子交换层析填料；c
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【专利技术属性】
技术研发人员：陈伟峰，陶荣，徐会，李磊，
申请(专利权)人：上海迈晋生物医药科技有限公司，
类型：发明
国别省市：
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