核酸构建体及其用于治疗脊髓性肌肉萎缩症的用途制造技术

本申请公开了一种核酸，其包含第一核酸区和第二核酸区，第一核酸区包含编码SMN蛋白或其变体的核酸序列；第二核酸区包含一种或多种内源性微RNA的一个或多个靶段，其中第二核酸区位于第一核酸区的3

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】核酸构建体及其用于治疗脊髓性肌肉萎缩症的用途
相关申请的交叉引用
[0001]本申请要求2020年8月5日提交的PCT专利申请号PCT/CN2020/107173以及2020年12月21日提交的PCT专利申请号PCT/CN2020/138056的权益，以上每项申请均通过引用以其全文并入本文。以电子方式提交的序列表的引用
[0002]本申请包含序列表，该序列表是以ASCII格式的序列表连同文件“14652
‑
017228_SEQ_LISTING.txt”通过EFS
‑
Web进行电子提交的，该文件于2021年7月21日生成并且其大小为108,587字节。通过EFS
‑
Web提交的序列表是本说明书的一部分，并且通过引用以其全文并入本文。
1.

[0001]本公开涉及核酸构建体、基于此类构建体的基因疗法及其用途方法。
2.
技术介绍

[0002]脊髓性肌萎缩症(SMA)是一种常染色体隐性神经退行性疾病，其特点是由于下运动神经元的丧失而导致进行性肌肉无力和肌张力低下。根据发病年龄和神经肌肉症状的严重程度，已经描述有四种临床表型(Lunn和Wang,Lancet[柳叶刀],371(9630):2120
‑
33(2008))。最严重的类型，即1型SMA，是一种破坏性的儿童疾病，也被称为韦德尼希
‑
霍夫曼病(Werdnig
‑
Hoffmann disease)。导致大多数SMA病例的基因，即生存运动神经元(SMN)，被确定位于染色体位点5q13(Lefebvre等,Cell[细胞],80(1):155
‑
65(1995))。人类的基因是由端粒和着丝粒拷贝，分别是SMN1和SMN2叠加的。SMA是由SMN1基因的突变或缺失引起的，由于SMN2不能产生足够数量的全长蛋白，导致SMN蛋白的耗尽。
[0003]基于增强SMN基因的表达，产生了包括基因疗法在内的治疗策略。然而，目前可用的治疗方法面临各种挑战，例如包括，SMN基因的表达水平不足和脱靶毒性。因此，本领域需要改进SMA的基因疗法，优化SMN的表达并降低脱靶毒性。3.概述
[0004]在一方面，本文提供了一种核酸，其包含(i)第一核酸区，包含编码SMN蛋白或其变体的核酸序列；和(ii)第二核酸区，包含一种或多种内源性微RNA(miRNA)的一个或多个靶段，其中第二核酸区位于第一核酸区的3
’
。
[0005]在一些实施例中，SMN蛋白或其变体包含如SEQ ID NO:33所示的氨基酸序列或与SEQ ID NO:33具有至少80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％同一性的氨基酸序列。
[0006]在一些实施例中，第一核酸区包含选自由SEQ ID NO:34和SEQ ID NO:35组成的组的核酸序列。
[0007]在一些实施例中，第二核酸区包含心脏中内源性miRNA的至少一个靶段。在一些实施例中，心脏中内源性miRNA选自由hsa
‑
mir
‑1‑
5p、hsa
‑
mir
‑
208a
‑
5p、hsa
‑
mir
‑
208b
‑
5p、
hsa
‑
mir
‑
133a
‑
1和hsa
‑
mir
‑
488
‑
5p组成的组。在一些实施例中，心脏中内源性miRNA包含选自由以下项组成的组的核酸序列：与SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:5或SEQ ID NO:6有至少80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％相同的核酸序列。
[0008]在一些实施例中，第二核酸区包含肝脏中内源性miRNA的至少一个靶段。在一些实施例中，肝脏中内源性miRNA是hsa
‑
mir
‑
122。在一些实施例中，肝脏中内源性miRNA包含与SEQ ID NO:4有至少80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％相同的核酸序列。
[0009]在一些实施例中，第二核酸区包含hsa
‑
mir
‑
133a
‑
1的两个或多个靶段。在一些实施例中，第二核酸区包含hsa
‑
mir
‑
133a
‑
1的至少三个靶段。在一些实施例中，第二核酸区包含hsa
‑
mir
‑
208a
‑
5p的至少一个靶段、hsa
‑
mir
‑
208b
‑
5p的至少一个靶段、hsa
‑
mir
‑
122的至少一个靶段和hsa
‑
mir
‑
133a
‑
1的至少一个靶段。在一些实施例中，第二核酸区包含hsa
‑
mir
‑
208a
‑
5p的两个靶段、hsa
‑
mir
‑
208b
‑
5p的两个靶段、hsa
‑
mir
‑
122的三个靶段和hsa
‑
mir
‑
133a
‑
1的三个靶段。
[0010]在一些实施例中，hsa
‑
mir
‑1‑
5p的靶段包含与SEQ ID NO:7有至少80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％相同的核酸序列；hsa
‑
mir
‑
208a
‑
5p的靶段包含与SEQ ID NO:8有至少80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％相同的核酸序列；hsa
‑
mir
‑
208b
‑
5p的靶段包含与SEQ ID NO:9有至少80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％相同的核酸序列；hsa
‑
mir
‑
122的靶段包本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】1.一种核酸，包含：(i)第一核酸区，包含编码SMN蛋白或其变体的核酸序列；和(ii)第二核酸区，包含一种或多种内源性微RNA(miRNA)的一个或多个靶段，其中所述第二核酸区位于所述第一核酸区的3
’
。2.如权利要求1所述的核酸，其中所述SMN蛋白或其变体包含如SEQ ID NO:33所示的氨基酸序列或与SEQ ID NO:33具有至少80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％同一性的氨基酸序列。3.如权利要求1或2所述的核酸，其中所述第一核酸区包含选自由SEQ ID NO:34和SEQ ID NO:35组成的组的核酸序列。4.如权利要求1至3中任一项所述的核酸，其中所述第二核酸区包含心脏中内源性miRNA的至少一个靶段。5.如权利要求4所述的核酸，其中所述心脏中内源性miRNA选自由hsa
‑
mir
‑1‑
5p、hsa
‑
mir
‑
208a
‑
5p、hsa
‑
mir
‑
208b
‑
5p、hsa
‑
mir
‑
133a
‑
1和hsa
‑
mir
‑
488
‑
5p组成的组。6.如权利要求4所述的核酸，其中所述心脏中内源性miRNA包含选自由以下项组成的组的核酸序列：与SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:5或SEQ ID NO:6有至少80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％相同的核酸序列。7.如权利要求1至6中任一项所述的核酸，其中所述第二核酸区包含肝脏中内源性miRNA的至少一个靶段。8.如权利要求7所述的核酸，其中所述肝脏中内源性miRNA是hsa
‑
mir
‑
122。9.如权利要求7所述的核酸，其中所述肝脏中内源性miRNA包含与SEQ ID NO:4有至少80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％相同的核酸序列。10.如权利要求1至3中任一项所述的核酸，其中所述第二核酸区包含hsa
‑
mir
‑
133a
‑
1的两个或多个靶段。11.如权利要求10所述的核酸，其中所述第二核酸区包含hsa
‑
mir
‑
133a
‑
1的至少三个靶段。12.如权利要求1至3中任一项所述的核酸，其中所述第二核酸区包含hsa
‑
mir
‑
208a
‑
5p的至少一个靶段、hsa
‑
mir
‑
208b
‑
5p的至少一个靶段、hsa
‑
mir
‑
122的至少一个靶段和hsa
‑
mir
‑
133a
‑
1的至少一个靶段。13.如权利要求12所述的核酸，其中所述第二核酸区包含hsa
‑
mir
‑
208a
‑
5p的两个靶段、hsa
‑
mir
‑
208b
‑
5p的两个靶段、hsa
‑
mir
‑
122的三个靶段和hsa
‑
mir
‑
133a
‑
1的三个靶段。14.如权利要求5、8和10至13中任一项所述的核酸，其中：(i)所述hsa
‑
mir
‑1‑
5p的靶段包含与SEQ ID NO:7有至少80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％相同的核酸序列；(ii)所述hsa
‑
mir
‑
208a
‑
5p的靶段包含与SEQ ID NO:8有至少80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％相同的核酸序列；
(iii)所述hsa
‑
mir
‑
208b
‑
5p的靶段包含与SEQ ID NO:9有至少80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％相同的核酸序列；(iv)所述hsa
‑
mir
‑
122的靶段包含与SEQ ID NO:10有至少80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％相同的核酸序列；(v)所述hsa
‑
mir
‑
133a
‑
1的靶段包含与SEQ ID NO:11有至少80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％相同的核酸序列；和/或(vi)所述hsa
‑
mir
‑
488
‑
5p的靶段包含与SEQ ID NO:12有至少80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％相同的核酸序列。15.如权利要求1至3中任一项所述的核酸，其中所述第二核酸区包含SEQ ID NO:11的核酸序列的至少3个重复。16.如权利要求15所述的核酸，其中所述第二核酸区进一步包含肝脏中内源性miRNA的一个或多个靶段。17.如权利要求1至3中任一项所述的核酸，其中所述第二核酸区包含：(i)具有如SEQ ID NO:8所示的核酸序列的靶段的2个重复，(ii)具有如SEQ ID NO:9所示的核酸序列的靶段的2个重复，(iii)具有如SEQ ID NO:10所示的核酸序列的靶段的3个重复，和(iv)具有如SEQ ID NO:11所示的核酸序列的靶段的3个重复。18.如权利要求1至17中任一项所述的核酸，其中所述第二核酸区进一步包含靶段间的一个或多个接头；并且其中可选地，所述接头包含1至10个核苷酸。19.如权利要求18所述的核酸，其中所述接头包含选自由SEQ ID NO:13、SEQ ID NO:14、SEQ ID NO:15、SEQ ID NO:16和SEQ ID NO:17组成的组的核酸序列。20.如权利要求1至3中任一项所述的核酸，其中所述第二核酸区包含：(i)与SEQ ID NO:18有至少80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％相同的核酸序列；(ii)与SEQ ID NO:19有至少80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％相同的核酸序列；(iii)与SEQ ID NO:20有至少80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％相同的核酸序列；或(iv)与SEQ ID NO:21有至少80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％相同的核酸序列。21.如权利要求1至20中任一项所述的核酸，其中所述第一核酸区进一步包含：(i)具有如SEQ ID NO:36或SEQ ID NO:37所示的核酸序列的启动子；(ii)包含CMV增强子和hSyn启动子的启动子；(iii)包含proC3增强子和hSyn启动子的启动子；
(iv)包含proA5增强子和hSyn启动子的启动子；或(v)包含proB15增强子和hSyn启动子的启动子，其中可选地，所述hSyn启动子包含如SEQ ID NO:38所示的核酸序列，所述CMV增强子包含如SEQ ID NO:39所示的核酸序列，所述proC3增强子包含如SEQ ID NO:40所示的核酸序列，所述proA5增强子包含如SEQ ID NO:41所示的核酸序列，和/或所述proB15增强子包含如SEQ ID NO:42所示的核酸序列。22.一种载体，包含如权利要求1至21中任一项所述的核酸。23.如权利要求22所述的载体，其中所述载体是病毒载体。24.如权利要求23所述的载体，其中所述病毒载体是腺相关病毒(AAV)载体。25.如权利要求24所述的载体，其中所述AAV载体源自AAV1、AAV2、AAV2i8、AAV3、AAV3
‑
B、AAV4、AAV5、AAV6、AAV7、AAV8、AAVrh8、AAVrh8R、AAV9、AAV10、AAVrh10、AAV11、AAV12、AAV13、AAV
‑
DJ、AAV LK03、AAVrh74、AAV44
‑
9，或其组合或变体。26.如权利要求25所述的载体，其中所述载体是重组AVV9(rAAV9)载体或其变体。27.一种重组AAV(rAAV)载体，包含：(i)第一核酸区，包含转基因；和(ii)第二核酸区，包含一种或多种内源性miRNA的一个或多个靶段，其中至少一个靶段是心脏中内源性miRNA的靶段，并且至少一个靶段是肝脏中内源性miRNA的靶段；其中所述第二核酸区位于所述第一核酸区的3
’
；以及其中所述rAAV载体包含源自AAV1、AAV2、AAV2i8、AAV3、AAV3
‑
B、AAV4、AAV5、AAV6、AAV7、AAV8、AAVrh8、AAVrh8R、AAV9、AAV10、AAVrh10、AAV11、AAV12、AAV13、AAV
‑
DJ、AAV LK03、AAVrh74或AAV44
‑
9的末端反向重复(ITR)。28.如权利要求27所述的rAAV载体，其中所述第一核酸区包含编码SMA蛋白或其变体的核酸序列，所述SMA蛋白或其变体包含如SEQ ID NO:33所示的氨基酸序列或与SEQ ID NO:33具有至少80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％同一性的氨基酸序列。29.如权利要求27或28所述的核酸，其中所述第一核酸区包含选自由SEQ ID NO:34和SEQ ID NO:35组成的组的核酸序列。30.如权利要求27至29中任一项所述的rAAV载体，其中所述心脏中内源性miRNA选自由hsa
‑
mir
‑1‑
5p、hsa
‑
mir
‑
208a
‑
5p、hsa
‑
mir
‑
208b
‑
5p、hsa
‑
mir
‑
133a
‑
1和hsa
‑
mir
‑
488
‑
5p组成的组；和/或其中所述肝脏中内源性miRNA是hsa
‑
mir
‑
122。31.如权利要求和27至29中任一项所述的rAAV载体，其中：(i)所述心脏中内源性miRNA包含选自由以下项组成的组的核酸序列：与SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:5或SEQ ID NO:6有至少80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％相同的核酸序列；和/或(ii)所述肝脏中内源性miRNA包含选自由以下项组成的组的核酸序列：与SEQ ID NO:4有至少80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％相同的核酸序列。32.如权利要求27至29中任一项所述的rAAV载体，其中所述第二核酸区包含hsa
‑
mir
‑
133a
‑
1的两个或多个靶段。33.如权利要求32所述的rAAV载体，其中所述第二核酸区包含hsa
‑
mir
...

【专利技术属性】
技术研发人员：朱培新，叶国杰，吴振华，王立军，
申请(专利权)人：杭州嘉因生物科技有限公司，
类型：发明
国别省市：