新型布鲁氏菌菌壳疫苗及其应用制造技术

本发明专利技术涉及基因工程技术领域，具体涉及新型布鲁氏菌菌壳疫苗及其应用。本发明专利技术提供了缺失尿苷二磷酸葡萄糖焦磷酸化酶UGPase基因且包含噬菌体裂解蛋白E基因的新型布鲁氏菌及其制备方法，进一步提供了包含所述新型布鲁氏菌的新型布鲁氏菌菌壳疫苗及其制备方法。与现有弱毒疫苗和传统疫苗相比，本发明专利技术提供的新型布鲁氏菌菌壳疫苗在保留完整抗原结构的前提下提高了安全性、免疫保护效果好、生产工艺简单，且可实现鉴别诊断自然感染和疫苗免疫布鲁氏菌的动物。菌的动物。

【技术实现步骤摘要】
新型布鲁氏菌菌壳疫苗及其应用


[0001]本专利技术涉及基因工程
，具体涉及新型布鲁氏菌菌壳疫苗及其应用。

技术介绍

[0002]细菌菌壳是一种缺少细胞浆和核酸而导致无繁殖能力的细菌空壳形态。自然形成的菌壳是由感染了噬菌体Phi X174的大肠杆菌在溶菌周期由于宿主细胞裂解而形成的；人为制备菌壳技术主要利用基因工程技术依赖大肠杆菌噬菌体Phi X174的裂解基因E的表达产物，在其寡聚化、构象改变及其它生化反应使大多数革兰氏阴性细菌形成一个40
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200nm直径的跨膜孔道，导致宿主菌的细胞浆和核酸等细胞内容物在渗透作用下外流而溶菌形成菌壳。由于该技术制备菌壳过程中没有蛋白变性，菌壳保留了与活菌完全一样的细胞膜结构和相关抗原蛋白，从而没有任何免疫原性的改变，是一种新型非变性灭活菌苗，比传统甲醛灭活菌苗在理论上具有更好的免疫原性和免疫保护效果。
[0003]布鲁氏菌目前在人畜间的危害日益加剧，给动物健康养殖、畜产品安全、公共卫生安全及进出口贸易带来了严重的危害。人间传播的报道时常发生，已达历史最高峰，染病动物是主要传染源，目前仍无人用疫苗。近些年来随着动物流动性与养殖密度的增加，布病也呈爆发式增长，处于历史高度流行期。疫苗接种是预防传染病最有效的方法，在布病的防控与净化过程中尤为如此。目前国内外使用的疫苗多为弱毒疫苗，主要为S2、M5、S19、A19等，虽然这些疫苗在防控动物布病上起到了一定的作用，但是因为其安全性较差，可致孕畜流产，还可以感染人；其可造成免疫抑制，导致免疫保护率不高；其具有一定毒力，可发生毒力返强、破坏生态环境；无法区分自然感染和疫苗免疫动物等缺陷严重地限制了布鲁氏菌病疫苗在防控过程中发挥的作用，导致目前布病疫苗免疫密度不高，造成动物布病流行的不利局面。
[0004]在1982年，国外Young K和Henrich B等最早开始研究菌壳技术，直至2004年国内才见诸报道菌壳技术研究，但发展较快已成功构建了多种大肠杆菌、副猪嗜血杆菌、多杀性巴氏杆菌、嗜水单气胞菌、胸膜肺炎放线杆菌、迟缓爱德华菌、伤寒沙门氏菌、柱状黄杆菌及布鲁氏菌等菌壳，并都能达到可观的溶菌率，用这些制备的菌壳作为非变性灭活疫苗比传统甲醛灭火菌苗能有较为理想的免疫效果。王丽哲等制备的大肠杆菌O138菌影可以刺激机体产生对大肠杆菌O138抗原的特异性免疫应答，且经腹腔注射和口服免疫的保护率分别为100％和70％。常月红等制备的胸膜肺炎放线杆菌菌壳经肌肉注射免疫后，可产生一定的抗体水平，对于同型和非同型APP的攻毒均具有一定的免疫保护效果。刘东胜等制备的多杀性巴氏杆菌菌壳可使小鼠产生较好的免疫保护，其保护率高达100％。王雪鹏等制备的迟缓爱德华菌菌壳疫苗和付立霞等制备的嗜水气单胞菌菌壳疫苗对于预防鱼类细菌性疾病具有潜在的价值。因此，菌壳疫苗预防传染性细菌疾病大有可为，应用前景广阔。
[0005]目前市售的布鲁氏菌疫苗均为弱毒疫苗，如S2、M5、S19、A19等，虽然这些疫苗效力较高、保护周期久，但是也存在严重的不足，严重制约了疫苗免疫在动物布病防控中的作用。主要问题：1)安全性差，导致孕畜流产，可感染人；2)菌株均为自然弱毒的菌株，免疫后
可造成免疫抑制，免疫保护率不高，抗体水平持续时间较短；3)接种后容易出现毒力返强，自然排毒等，破坏生态环境；4)疫苗所选菌株均为平滑型菌株，无法区分自然感染和疫苗免疫动物，导致当前动物布病疫苗的免疫密度较低，无法真正有效防控动物布病的流行。
[0006]安全有效的灭活疫苗是当前产业急需的产品，而传统甲醛灭活的疫苗因破坏了布鲁氏菌表面完整的抗原结构，导致其免疫有效期较短，免疫保护力不佳，无法有效开展动物布病防控；因为布鲁氏菌感染和免疫机制较为复杂，有效抗原的筛选较难，一些基因工程亚单位疫苗均停留在实验室研究阶段，还无法投入生产，在临床应用。
[0007]以上这些问题，是当前布动物布病疫苗研究的技术瓶颈，严重制约了我国动物布病新型疫苗的研发与应用。

技术实现思路

[0008]有鉴于此，本专利技术要解决的技术问题在于提供新型布鲁氏菌菌壳疫苗及其应用，本专利技术提供的新型布鲁氏菌菌壳疫苗保留了细菌表面完整的抗原决定簇，免疫原性和免疫保护效果更佳，更安全，且能够有效区分布鲁氏菌自然感染和疫苗免疫的动物。
[0009]本专利技术提供了新型布鲁氏菌，其缺失尿苷二磷酸葡萄糖焦磷酸化酶UGPase基因且包含噬菌体裂解蛋白E基因；
[0010]所述尿苷二磷酸葡萄糖焦磷酸化酶UGPase基因具有如SEQ ID NO:1所示的核苷酸序列，所述噬菌体裂解蛋白E基因具有如SEQ ID NO:2所示的核苷酸序列。
[0011]在一些具体实施例中，所述新型布鲁氏菌的底盘菌为羊布鲁氏菌16M菌株。
[0012]本专利技术提供的新型布鲁氏菌由于缺失尿苷二磷酸葡萄糖焦磷酸化酶UGPase基因且包含噬菌体裂解蛋白E基因，改变了菌体的表面结构，极大减弱了与自然感染的布病阳性血清的免疫反应，可实现鉴别诊断作用。
[0013]本专利技术还提供了所述的新型布鲁氏菌的制备方法，包括对底盘菌中的尿苷二磷酸葡萄糖焦磷酸化酶UGPase基因进行突变并引入噬菌体裂解蛋白E基因后获得。
[0014]进一步的，所述尿苷二磷酸葡萄糖焦磷酸化酶UGPase基因的突变包括：构建含有UGPase基因的自杀质粒，将其电转化入羊布鲁氏菌16M感受态细胞中培养，经筛选和鉴定后获得布鲁氏菌UGPase基因缺失株。
[0015]更进一步的，所述噬菌体裂解蛋白E基因的引入包括：构建含有噬菌体裂解蛋白E基因的质粒，将其电转化入所述布鲁氏菌UGPase基因缺失株中，经筛选和鉴定后获得所述新型布鲁氏菌。
[0016]在一些具体实施例中，所述质粒为温度敏感型质粒。
[0017]本专利技术通过基因缺失技术和菌壳制备技术，分别在布鲁氏菌基因组上缺失尿苷二磷酸葡萄糖焦磷酸化酶UGPase基因，构建了可实现鉴别诊断的布鲁氏菌基因缺失株，并以此菌株为基础转入噬菌体裂解蛋白E基因温度敏感型质粒，与现有布鲁氏菌株相比，本专利技术的新型布鲁氏菌保留了细菌表面完整的抗原决定簇，免疫原性和免疫保护效果更佳，同时更安全，从未提供了更准确的技术效果。
[0018]本专利技术提供了所述的新型布鲁氏菌或所述的制备方法制得的新型布鲁氏菌在制备新型布鲁氏菌疫苗中的应用。
[0019]本专利技术提供了新型布鲁氏菌疫苗，包括如下
①
或
②
所述新型布鲁氏菌的菌壳疫苗
和佐剂：
[0020]①
、所述的新型布鲁氏菌；
[0021]②
、所述的制备方法制得的新型布鲁氏菌。
[0022]与传统灭活疫苗相比，本专利技术的新型布鲁氏菌菌壳疫苗保留了细菌表面完整的抗原决定簇，免疫原性和免疫保护效果更佳，同时更安全，从而提供了更准确的技术效果。
[0023]在一些具体的实施例中，所述佐剂为HMT31，所述菌壳疫苗中新型布鲁氏菌的含量为9.3
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【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.新型布鲁氏菌，其特征在于，其缺失尿苷二磷酸葡萄糖焦磷酸化酶UGPase基因且包含噬菌体裂解蛋白E基因；所述尿苷二磷酸葡萄糖焦磷酸化酶UGPase基因具有如SEQ ID NO:1所示的核苷酸序列，所述噬菌体裂解蛋白E基因具有如SEQ ID NO:2所示的核苷酸序列。2.根据权利要求1所述的新型布鲁氏菌，其特征在于，所述新型布鲁氏菌的底盘菌为羊布鲁氏菌16M菌株。3.权利要求1或2所述的新型布鲁氏菌的制备方法，其特征在于，包括对底盘菌中的尿苷二磷酸葡萄糖焦磷酸化酶UGPase基因进行突变并引入噬菌体裂解蛋白E基因后获得。4.根据权利要求3所述的制备方法，其特征在于，所述尿苷二磷酸葡萄糖焦磷酸化酶UGPase基因的突变包括：构建含有UGPase基因的自杀质粒，将其电转化入羊布鲁氏菌16M感受态细胞中培养，经筛选和鉴定后获得布鲁氏菌UGPase基因缺失株。5.根据权利要求4所述的制备方法，其特征在于，所述噬菌体裂解蛋白E基因的引入包括：构建含有噬菌体裂解蛋白E基因的质粒，将其电转化入所述布鲁氏菌UGPase基因缺失株中，经筛选和鉴定后获得所述新型布鲁氏菌。6.权利要求1或2所述的新型布鲁氏菌或权利要求3～5任一项所...

【专利技术属性】
技术研发人员：杨艳玲，高阳，张如，宮士越，万洪理，倪佳，张海威，曹敬凯，张东，
申请(专利权)人：中国农业科学院特产研究所，
类型：发明
国别省市：