用于制备预防和/或治疗雄激素源性脱发药物筛选的细胞模型及其构建方法和应用技术

本发明专利技术涉及一种用于制备预防和/或治疗雄激素源性脱发药物筛选的细胞模型及其构建方法和应用，构建方法包括以下步骤：1)取人源头部后枕区的毛囊，取得毛囊毛球部；2)将毛囊毛球部清洗、胶原酶消化，获得毛乳头悬浮液；3)用含抗生素和胎牛血清的DEME/F

【技术实现步骤摘要】
用于制备预防和/或治疗雄激素源性脱发药物筛选的细胞模型及其构建方法和应用


[0001]本专利技术涉及医疗用品领域，尤其涉及一种雄激素源性脱发的细胞模型的构建方法、用于制备预防和/或治疗雄激素源性脱发药物筛选的细胞模型，及其应用。

技术介绍

[0002]雄激素性脱发(androgenic alopecia，AGA)是一种雄激素依赖的遗传性疾病，是临床最常见的脱发类型，占到总脱发95％，表现为进行性头发径的变细、头发密度的降低和脱发，直至出现不同程度的秃发。
[0003]AGA病因复杂，具体发病机制仍不清楚。除了遗传方面因素，雄激素可能导致AGA发生的理论越发成熟。已有研究表明，患者真皮乳头细胞(HDPCs)中的5α
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还原酶将外周睾酮(T)转化为二氢睾酮(DHT)，DHT与其细胞核中的雄激素受体(AR)结合，启动一系列反应导致AGA的发生。因此，雄激素性脱发模型的构建有利于进一步探索雄激素性脱发的病理机制并且用于药物筛选。
[0004]目前AGA相关模型主要分为动物模型和器官模型，前者主要以小鼠为实验体，开发成本高，构建周期长，存在巨大的种属差异，结果难以转化到临床。后者毛囊微器官在体外仅能维持生长两周，研究窗口窄，且体外给予雄激素诱导的毛囊细胞凋亡并不能完全模仿AGA体内的毛囊相关病理变化过程。
[0005]相比于动物模型和器官模型，Itami,S等人(Itami S,Kurata S,Sonoda T,et al.Interaction between dermal papilla cells and follicular epithelial cells in vitro:Effect of androgen[J].British Journal of Dermatology,1995,132(4):527
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532.)为阐明雄激素驱动毛乳头细胞对毛囊表皮细胞的调节作用，建立了更精细化的雄激素性脱发细胞模型，将外根鞘细胞(ORS)和人真皮乳头细胞分别放在Transwell培养皿的上、下室进行共培养，并加入睾酮(T)刺激，证明了不同身体部位来源的人真皮乳头细胞对睾酮的敏感程度不同且雄激素受体表达量不同，具体来讲：(1)雄激素受体在胡须和腋窝来源的人真皮乳头细胞(HDPCs)中能检测到，而在枕部头皮来源的HDPCs中未检测到；(2)睾酮对单独培养的ORS和(胡须或腋窝或枕部来源的)HDPCs都没有增殖影响。(3)当外根鞘细胞与胡须或腋窝来源HDPCs共培养时，睾酮会显著刺激ORS的增殖；而当来自枕部头皮毛囊的HDPCs用于培养时，没有观察到这种效果。且睾酮的这种增殖作用是浓度依赖性的，并被醋酸环丙孕酮拮抗。后续很多科学家利用这种共培养模型进行雄激素诱导脱发的机制研究，包括DHT刺激DP细胞分泌DKK
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1抑制外根鞘角化细胞生长、雄激素诱导的TGF
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β1抑制上皮细胞生长等。
[0006]该文献中的细胞模型主要聚焦于雄激素驱动真皮乳头细胞对外根鞘细胞的调节作用，认为雄激素对DP细胞本身增殖没有影响，故后续研究中一般都不单独采用DP细胞作为雄激素源性脱发的细胞模型。
[0007]最近，Danlan,Fu等建立了AGA小鼠模型，其发现二氢睾酮(DHT)促进毛囊中细胞雄
激素受体(AR)的表达(且具有DHT浓度依赖性)，导致小鼠的早期毛发退化、毛发小型化、毛发密度损失和毛发形态变化，这些DHT的作用可以被AR拮抗剂比卡鲁胺部分逆转。(Fu D,Huang J,Li K,et al.Dihydrotestosterone
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induced hair regrowth inhibition by activating androgen receptor in C57BL6 mice simulates androgenetic alopecia[J].Biomedicine&Pharmacotherapy,2021,137:111247.)；另外，Flores A等发现乳酸脱氢酶(LDHA)对生发周期和毛囊干细胞的激活至关重要。LDHA表达水平在毛囊进入休止期时显著增加，催化丙酮酸生成乳酸，然后又在新一轮毛发生长后，即毛囊干细胞回到静止状态时再次降低。(Flores A,Schell J,Krall A S,et al.Lactate dehydrogenase activity drives hair follicle stem cell activation[J].Nature Cell Biology,2017,19(9):1017.)。而动物模型也不能完全模拟体内雄激素脱发的特点。
[0008]而现有的细胞模型，多为共培养模型，即采用供者秃区的DP细胞和外根鞘共培养，研究雄激素在共培养模型中对外根鞘细胞的影响。但存在如下问题：一方面供者秃区毛囊本就稀少，一般排斥在秃区取样，导致秃区的HDPCs细胞难以获得，大大增加了AGA脱发的治疗和研究难度；另一方面共培养模型忽略了雄激素对DP细胞本身增殖的影响，并不能很好的模拟雄激素脱发的特点。

技术实现思路

[0009]技术问题
[0010]有鉴于此，本专利技术要解决的技术问题是，如何提供一种雄激素源性脱发的细胞模型的构建方法、用于制备预防和/或治疗雄激素源性脱发药物筛选的细胞模型，及其应用。
[0011]本专利技术的采用人头部后枕区来源的HDPCs细胞，意外发现其增殖和雄激素受体(AR)、乳酸脱氢酶(LDHA)的表达受到雄激素(DHT)的调控作用，并呈现明显的DHT浓度依赖性，这也和Danlan,Fu和Flores A等人的小鼠模型体内数据高度一致，可以作为细胞模型，用来模拟真皮乳头细胞的功能和雄激素的相互作用，为研究和治疗脱发提供参考。并克服了本领域技术人员一般采用供者秃区毛囊研究脱发的技术偏见。
[0012]解决方案
[0013]为解决以上技术问题，本专利技术提供如下技术方案：
[0014]第一方面，本专利技术提供一种雄激素源性脱发的细胞模型的构建方法，包括以下步骤：
[0015]1)取人源头部后枕区的毛囊，取得毛囊毛球部；
[0016]2)将毛囊毛球部清洗、胶原酶消化，获得毛乳头悬浮液；
[0017]3)用含抗生素和胎牛血清的DEME/F
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12培养基重悬，培养获得人后枕区的真皮乳头细胞；
[0018]4)将P2
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P4代的步骤3)中的真皮乳头细胞，用TrypLE Express消化后，接种预培养，加入终浓度4～64μM的二氢睾酮，继续培养，获得雄激素源性脱发的细胞模型。
[0019]进一步地，步骤2)中，胶原酶的工作浓度为1.5～2.5mg/mL。
[0020]进一步地，步骤3)中，培养基为含1％青链霉素
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链霉素和10％胎牛血清的DEME/F
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12培养基。
[0021]进一步地，本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种用于制备预防和/或治疗雄激素源性脱发药物筛选的细胞模型的构建方法，其特征在于，包括以下步骤：1)取人源头部后枕区的毛囊，取得毛囊毛球部；2)将毛囊毛球部清洗、胶原酶消化，获得毛乳头悬浮液；3)用含抗生素和胎牛血清的DEME/F
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12培养基重悬，培养获得人后枕区的真皮乳头细胞；4)将P2
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P4代的步骤3)中的真皮乳头细胞，用TrypLE Express消化后，接种预培养，加入终浓度4～64μM的二氢睾酮，继续培养，获得雄激素源性脱发的细胞模型。2.根据权利要求1所述的构建方法，其特征在于，步骤2)中，胶原酶的工作浓度为1.5～2.5mg/mL。3.根据权利要求1或2所述的构建方法，其特征在于，步骤3)中，培养基为含1％青链霉素
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链霉素和10％胎牛血清的DEME/F
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【专利技术属性】
技术研发人员：方金辉，姚慧，
申请(专利权)人：北京星辉再生科技有限责任公司，
类型：发明
国别省市：