一种酸敏融合肽靶向外泌体及其制备方法和应用技术

本发明专利技术提供了一种酸敏融合肽靶向外泌体及其制备方法和应用，涉及生物医药技术领域。本发明专利技术首次将具有靶向肿瘤微环境的pHLIP与HEK293T来源的外泌体膜表面蛋白Lactadherin的C1C2结构域结合，制备得到具有靶向肿瘤作用的外泌体；并以该靶向外泌体作为载体来装载有抗肿瘤作用的中药单体莪术醇，成功构建具有靶向肿瘤作用的CUR

【技术实现步骤摘要】
一种酸敏融合肽靶向外泌体及其制备方法和应用


[0001]本专利技术涉及生物医药
，具体涉及一种酸敏融合肽靶向外泌体及其制备方法和应用。

技术介绍

[0002]胃癌(Gastric Cancer,GC)是全球常见的五大癌症之一，已被确定为全球癌症相关死亡的主要原因之一，根据国际癌症机构的统计，截止到2020年，全球胃癌新发病例100多万例，死亡病例约76.9万例。胃癌患者由于早期临床症状不显著,特异性指标较差，因此超过70％患者在确诊时处于晚期，错过手术和放疗的最佳时期。而传统的化疗药物和靶向治疗药物，由于耐药性和细胞毒性的副作用，使其在临床治疗效果逐渐不佳。因此，寻找新型抗癌药物具有重要意义，尤其是低毒、高效的抗肿瘤药物是当今世界研究的重点和热点。与合成的化学药物相比，来源于天然植物的中药有诸多优势，比如：低毒性、高安全性/途径多、靶点多等。
[0003]由于中药具有多种活性化合物的协同和药代动力学作用，使中药制剂在治疗各种疾病中发挥着突出的作用。目前临床上也有许多中药配方和中药单体已成功的用于抗肿瘤治疗。例如，中药单体
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姜黄素，其抗肿瘤作用已被广泛研究，能够抑制肿瘤的发生、进展、侵袭和转移等。研究者发现，在中医药抗胃癌治疗中，橙皮素单体能够通过上调PTEN表达促进顺铂诱导的体外和体内胃癌细胞凋亡。Zhang等人发现木犀草素通过影响细胞周期进程抑制肿瘤细胞活性从而来诱导胃癌细胞SGC
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7901的凋亡。尽管中药在临床研究中显示出良好的抗肿瘤性，但其往往存在稳定性低、水溶性差、体内代谢快、生物利用度低等缺点，使其在临床应用上受到限制，因此，急需一种稳定性和生物相容性良好的载体来改善其药物特性。
[0004]外泌体是由细胞内多泡体和细胞膜融合后，释放到细胞外的一种直径约30
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150nm的膜性囊泡，其中包含RNA、蛋白质、DNA片段等多种胞内物质。外泌体能在细胞间穿梭，有利于细胞间物质与信息的交换，可装载化疗药物及siRNA进行靶向治疗。外泌体作为药物载体具有天然的优势：(1)具备纳米级尺寸，在体内很容易逃过网状内皮系统的捕获；(2)具有磷脂双分子层结构，与细胞膜组成相似，对细胞膜具有较强的亲和力，便于进入细胞；(3)属于内源性囊泡，作为载体进入体内不会引起免疫反应，不会被体内的免疫系统鉴定为“非我物质”而吞噬；(4)其来源于细胞，表面含有众多跨膜蛋白，可以通过基因修饰的方式，在适当的蛋白末端加上能够靶向目标细胞的配体短肽，实现体内的靶向治疗。
[0005]低pH插入肽(pH low insertion peptide，pHLIP)来源于细菌视紫红质的C
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螺旋，是一种水溶性分子，以pH依赖性方式与脂质膜相互作用。pHLIP具有靶向酸性组织和双重递送能力，各种外源性分子可以通过与pHLIP的N端或者C端偶联，从而将它们靶向递送至细胞表面和细胞内。pHLIP已经被证明可以靶向肿瘤酸性微环境，其靶向递送系统对比传统的靶向纳米载体和穿膜肽具有特异性强的优势，在应用上pHLIP具有以下有利条件：pHLIP对肿瘤细胞中受体或抗原的异质性表达不敏感；pHLIP具有主动靶向酸性肿瘤微环境的特定标志；pHLIP不仅可以精准靶向原发肿瘤病灶和转移病灶，还可以利用pHLIP插入肿瘤细胞膜
表面的特性开发其更多方面的应用。pHLIP技术可以递送不同类型的功能性分子到细胞中用于治疗和诊断，在临床具有较好的应用前景，但目前仍然有不足之处需要优化，其中提高pHLIP和外源性分子的合成效率可以显著提高其临床转化能力。虽然pHLIP已被证实对酸性肿瘤微环境有特异性靶向作用，但还需要进一步的提高其靶向的效率，在临床应用时需要筛查患者有无炎症性疾病，从而提高pHLIP的特异性。

技术实现思路

[0006](一)解决的技术问题
[0007]针对现有技术的不足，本专利技术提供了一种酸敏融合肽靶向外泌体及其制备方法，所述外泌体用于制备具有靶向肿瘤作用的中药纳米载体和用于制备抗胃癌药物中的应用。
[0008](二)技术方案
[0009]为实现以上目的，本专利技术通过以下技术方案予以实现：
[0010]一方面，本专利技术提供了一种酸敏融合肽靶向外泌体，所述外泌体是包含有低pH插入肽与Lactadherin蛋白中与外泌体结合的结构域C1C2形成的融合蛋白。
[0011]进一步地，所述外泌体是包含有Lactadherin信号肽
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WT
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pHLIP
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Flag和C1C2
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HA连接形成的pHILP
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C1C2
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1融合蛋白；其中所述融合蛋白的基因序列如SEQ ID NO.1所示；其中Lactadherin信号肽
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WT
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pHLIP
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Flag序列如SEQ ID NO.2所示；C1C2
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HA序列如SEQ ID NO.3所示。
[0012]进一步地，所述外泌体还包含有具有保护作用的糖基化基序的融合蛋白pHILP
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C1C2
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2，所述融合蛋白的基因序列如SEQ ID NO.4所示。
[0013]又一方面，本专利技术还提供了一种酸敏融合肽靶向外泌体的制备方法，所述外泌体按照以下步骤制备：
[0014](1)利用重叠延伸PCR技术将合成的Lactadherin信号肽
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pHLIP
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Flag和C1C2
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HA基因序列连接为融合蛋白pHLIP
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C1C2
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1和pHLIP
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C1C2
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2；
[0015](2)将酸敏融合肽基因克隆至pCDH
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CMV
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MCS
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EF1
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GFP
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Puro慢病毒载体上的多克隆位点，获得重组质粒pCDH
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pHLIP
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C1C2
‑1‑
Puro和重组质粒pCDH
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PHLIP
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C1C2
‑2‑
Puro，分别简称为CT1和CT2；
[0016](3)将重组质粒pCDH
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PHLIP
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C1C2
‑1‑
Puro和pCDH
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PHLIP
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C1C2
‑2‑
Puro包装成慢病毒转染HEK293T细胞，并收集慢病毒液进行浓缩来感染HEK293T细胞；随后使用嘌呤霉素和倍数稀释法相结合来筛选单克隆细胞，获得稳定表达酸敏融合蛋白的HEK293T单克隆细胞株HEK293TCT1/CT2；
[0017](4)外泌体的提取
[0018]将稳转单克隆HEK2本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种酸敏融合肽靶向外泌体，其特征在于，所述外泌体包含有低pH插入肽与外泌体表面的Lactadherin蛋白中与外泌体结合的结构域C1C2形成的融合蛋白。2.根据权利要求1所述的一种酸敏融合肽靶向外泌体，其特征在于，所述外泌体是包含有Lactadherin信号肽
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WT
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pHLIP
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Flag和C1C2
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HA连接形成的pHILP
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C1C2
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1融合蛋白；其中所述融合蛋白的基因序列如SEQ ID NO.1所示；其中Lactadherin信号肽
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WT
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pHLIP
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Flag序列如SEQ ID NO.2所示；C1C2
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HA序列如SEQ ID NO.3所示。3.根据权利要求1所述的一种酸敏融合肽靶向外泌体，其特征在于，所述外泌体还包含有具有保护作用的糖基化基序的融合蛋白pHILP
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C1C2
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2，所述融合蛋白的基因序列如SEQ ID NO.4所示。4.一种酸敏融合肽靶向外泌体的制备方法，其特征在于，所述外泌体按照以下步骤制备：(1)利用重叠延伸PCR技术将合成的Lactadherin信号肽
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pHLIP
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Flag和C1C2
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HA基因序列连接为融合蛋白pHLIP
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C1C2
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1和pHLIP
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C1C2
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2；(2)将酸敏融合肽克隆至pCDH
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CMV
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MCS
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EF1
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GFP
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Puro慢病毒载体上的多克隆位点，获得重组质粒pCDH
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pHLIP
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C1C2
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Puro和重组质粒pCDH
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pHLIP
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C1C2
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Puro，分别简称为CT1和CT2；(3)将重组质粒pCDH
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pHLIP
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C1C2
‑1‑
Puro和pCDH
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pHLIP
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【专利技术属性】
技术研发人员：任伟宏，赵硕，刘盼盼，韩文彦，沙雨，贺娇，王钰娜，徐群燕，蒋露，郭梦琦，郭玲慧，刘朝阳，
申请(专利权)人：河南中医药大学第一附属医院，
类型：发明
国别省市：