基于CRISPR/Cas12a与链置换扩增相结合的凝胶响应距离传感器及其在生物检测中的应用制造技术

本发明专利技术提供了一种基于CRISPR/Cas12a与链置换扩增反应相结合的凝胶响应距离传感。本发明专利技术利用链置换扩增与CRISPR/Cas12a非特异性切割两步反应进行目标识别和信号放大，在滤纸上负载明胶等水凝胶作为截流模块，以亲水性棉线等一维通道作为距离信号输出载体，构建了凝胶响应距离传感器。以检测miRNA为例，目标物的存在会触发链置换扩增反应生成大量的dsDNA，接着dsDNA激活Cas12a酶非特异性地切割体系中磁珠

【技术实现步骤摘要】
基于CRISPR/Cas12a与链置换扩增相结合的凝胶响应距离传感器及其在生物检测中的应用


[0001]本专利技术属于生物传感与生物化学分析领域，具体涉及一种凝胶响应的距离传感器的构建及其在生物标志物检测中的应用。

技术介绍

[0002]即时检测(POCT)是在采样现场即刻分析快速得到检测结果的一类新方法，是检测诊断中快速发展的领域。POCT具有快速得出结果、便携、操作简单、成本低廉、无需专业技术人员操作等优点，这些优点使其更易于普及至寻常百姓家或边远、经济不发达等地区。此外，POCT对传染病的预防、阻止其进一步扩散亦具有重要的意义。然而，在实际检测中，目标物往往是微量且处于复杂环境中的，大多POCT的检测灵敏度、选择性不能满足检测需求；更重要的是，大多数POCT对目标物的定量分析其信号输出往往依赖额外的电子设备，如紫外分析仪、荧光仪等。上述问题限制了其在实际检测中的应用和发展。
[0003]基于距离信号输出的POCT装置可以很好地克服以上不足，类似于水银温度计的信号读出方式，基于距离信号输出的检测装置将目标物的含量转化为距离信号，通过读取距离的长短即可得到目标物的含量，无需额外的电子设备即可对目标物进行定量，并且与常见的比色法相比不容易受到用户个体解释的差异。此外，对于提高传感器的检测灵敏度，引入信号放大步骤被视为是有效的策略。因此，迫切需要开发一种无设备依赖裸眼定量的、高灵敏的POCT检测方法。

技术实现思路

[0004]本专利技术针对现有POCT方法检测灵敏度不足且需要额外电子设备对目标物进行定量的问题，提出了一种基于CRISPR/Cas12a与链置换扩增(SDA)反应相结合的凝胶响应距离传感器及其构建方法，可实现即时、高灵敏、裸眼定量检测目标物。
[0005]本专利技术为解决上述提出的问题所采用的技术方案为：
[0006]基于CRISPR/Cas12a与SDA反应相结合的凝胶响应距离传感器，包括目标识别和信号放大模块，截流模块和信号输出载体；所述目标识别和信号放大模块由SDA溶液体系、CRISPR/Cas12a溶液体系以及信号报告分子组合而成，用于待测样品溶液滴加于载流模块前的预处理；其中，所述信号报告分子为磁珠
‑
单链DNA
‑
酶的复合物，其中的酶为能够降解载流模块上的水凝胶的酶；所述截流模块是负载水凝胶的纸质基底，搭接于信号输出载体起始端的上方；所述信号输出载体为一维亲水通道，其材质为能产生毛细现象的亲水材料。
[0007]该凝胶响应距离传感器的目标物为能够直接或间接打开SDA溶液体系中的hDNA环状结构并引发SDA和Cas12a非特异性切割反应的分子，从而对信号报告分子中单链DNA进行切割，将酶从信号报告分子中释放，进而特异性酶解载流模块上的水凝胶改变其渗透性，在一维亲水通道上产生距离信号，根据距离信号对目标物进行定量分析。
[0008]按上述方案，所述水凝胶为能够将纸质基底的多孔结构封堵住并产生截流效果的
水凝胶，比如明胶水凝胶或者透明质酸凝胶等。其中，当水凝胶为明胶水凝胶时，所述磁珠
‑
单链DNA
‑
酶中的酶为胰蛋白酶；当水凝胶为透明质酸凝胶时，所述磁珠
‑
单链DNA
‑
酶中的酶为透明质酸酶。
[0009]按上述方案，所述纸质基底为有较大孔径、机械强度好、可较长时间浸泡在溶液保持完整形态的亲水性纸张，比如浸泡在溶液中不易腐烂的滤纸片，孔径可以为30
‑
150μm，优选孔径80
‑
120μm，能够实现负载水凝胶时产生溶液截留效果，水凝胶酶解后产生溶液渗透效果；所述一维亲水通道为丝光棉线等具有亲水性可产生毛细现象的材料。
[0010]按上述方案，所述凝胶响应距离传感器还包括支架和长度测量工具；所述支架用于固定截流模块和信号输出载体，所述长度测量工具用于测量输出的距离信号，固定在一维亲水通道延伸出纸质基底的起点处。
[0011]按上述方案，所述凝胶响应距离传感器还包括颜色指示剂，在待测样品溶液经所述目标识别和信号放大模块处理后加入其中，用于信号输出载体显色。
[0012]上述基于CRISPR/Cas12a与SDA反应相结合的凝胶响应距离传感器的构建方法，主要步骤如下：
[0013](1)制备负载水凝胶的纸质基底，作为截留模块；
[0014](2)将负载水凝胶的纸质基底搭接于信号输出载体一维亲水通道起始端的上方，使一维亲水材料的起始端指向或者穿过纸质基底的中心；
[0015](3)将酶(如胰蛋白酶Trypsin)与单链DNA(ssDNA)共价偶联到一起，得到Trypsin
‑
ssDNA复合物，之后将Trypsin
‑
ssDNA固定到链霉亲和素磁珠(MBs)上，得到MB
‑
ssDNA
‑
trypsin)，作为信号报告分子；
[0016](4)将含有发卡DNA(hDNA)、聚合酶(KFP)、脱氧核糖核苷三磷酸(dNTPs)的混合溶液，作为SDA溶液体系；将Cas12a与crRNA混合在缓冲溶液中孵育得到Cas12a/crRNA溶液，作为CRISPR/Cas12a溶液体系；CRISPR/Cas12a溶液体系和SDA溶液体系以及信号报告分子组合成目标识别和信号放大模块，用于处理待测溶液。
[0017]按上述方案，步骤(3)中，制备Trypsin
‑
ssDNA复合物可通过胺
‑
巯基交联剂Sulfo
‑
SMCC或者点击化学等方法将两者进行共价偶联，胰蛋白酶与ssDNA共价偶联时应保证胰蛋白酶与ssDNA摩尔比大于1:1。
[0018]按上述方案，步骤(3)中，ssDNA为poly(T)序列，序列长度为25个碱基，以序列为5
’‑
Biotin/TTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTT/SH C6
‑3’
为例；MBs尺寸大小为0.3μm
‑
1μm；Trypsin
‑
ssDNA复合物与MBs作用时，Trypsin
‑
ssDNA复合物过量，确保MBs上链霉亲和素位点完全反应。
[0019]上述基于CRISPR/Cas12a与SDA反应相结合的凝胶响应距离传感器检测生物样品中微量生物标志物的方法，主要步骤为：
[0020]a)将不同浓度目标物标准品加入含有hDNA、KFP、dNTPs的SDA溶液体系中，在37℃下反应一段时间，得到得SDA溶液体系；所述目标物为生物标志物；
[0021]b)将Cas12a与crRNA混合在1X buffer r2.1溶液中，37℃反应一段时间后，得到Cas12a/crRNA溶液，作为CRISPR/Cas12a溶液体系；
[0022]c)将步骤a)所得SDA溶液体系、步骤b)所得CRISPR/Cas12a溶本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.基于CRISPR/Cas12a与链置换扩增反应相结合的凝胶响应距离传感器，其特征在于，它包括截流模块和信号输出载体、目标识别和信号放大模块；所述截流模块是负载水凝胶的纸质基底，搭接于信号输出载体起始端的上方；所述信号输出载体为一维亲水通道，用于产生毛细现象输出距离信号；所述目标识别和信号放大模块由SDA溶液体系、CRISPR/Cas12a溶液体系以及信号报告分子组合而成，用于处理待测样品溶液；所述信号报告分子为磁珠
‑
单链DNA
‑
酶的复合物，作为Cas12a切割底物；该凝胶响应距离传感器的目标物为能够直接或间接打开SDA溶液体系中的hDNA环状结构并引发链置换扩增和Cas12a非特异性切割反应的分子，将酶从信号报告分子中释放并特异性酶解截流模块上的水凝胶改变其渗透性，实现对流至一维亲水通道上的液体量的控制，将目标物浓度转化为距离信号输出。2.根据权利要求1所述的基于CRISPR/Cas12a与链置换扩增反应相结合的凝胶响应距离传感器，其特征在于，所述纸质基底具有多孔结构；所述水凝胶为能够实现将纸质基底的多孔结构封堵并产生截流效果的水凝胶；所述凝胶响应距离传感器还包括颜色指示剂，在待测样品溶液经所述目标识别和信号放大模块处理后加入其中，用于信号输出载体显色。3.根据权利要求1所述的基于CRISPR/Cas12a与链置换扩增反应相结合的凝胶响应距离传感器，其特征在于，还包括支架和长度测量工具；所述支架用于固定截流模块和信号输出载体，所述长度测量工具用于测量输出的距离信号。4.权利要求1所述的凝胶响应距离传感器的构建方法，其特征在于，主要步骤如下：(1)制备负载水凝胶的纸质基底，作为截留模块；(2)将负载水凝胶的纸质基底搭接于信号输出载体一维亲水通道起始端的上方，使一维亲水通道的起始端指向或者穿过纸质基底的中心；(3)将酶与ssDNA共价偶联到一起，得到酶
‑
ssDNA复合物，之后将酶
‑
ssDNA复合物固定到磁珠上，得到磁珠
‑
ssDNA
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酶，作为信号报告分子；(4)将含有hDNA、聚合酶、dNTP的混合溶液，作为SDA溶液体系；将Cas12a与crRNA混合在缓冲溶液中孵育得到Cas12a/crRNA溶液，作为CRISPR/Cas12a溶液体系；SDA溶液体系、CRISPR/Cas12a溶液体系和信号报告分子组合成的目标识别和信号放大模块，用于处理待测样品溶液。5.根据权利要求4所述的凝胶响应距离传感器的构建方法，其特征在于，步骤(3)中，ssDNA为poly(T)序列；酶与ssDNA共价偶联时，酶与ssDNA摩尔比大于1:1；磁珠直径为0.3μm
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1.5μm；酶
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ssDNA复合物与磁珠作用时，酶
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ssDNA复合物过量。6.权利要求1所述的凝胶响应距离传感器检测生物样品中微量生物标志物的方法，其特征在于，主要步骤为：a)将不同浓度目标物标准品加入含有hDNA、聚合酶、dNTPs的SDA溶液体系中，在36
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38℃下反应；所述目...

【专利技术属性】
技术研发人员：刘志洪，吴婷婷，冯少琼，曹宇，
申请(专利权)人：武汉大学，
类型：发明
国别省市：