一种聚乙二醇定点修饰的雷珠单抗及其制备方法技术

本发明专利技术涉及生物医药领域，具体涉及一种聚乙二醇定点修饰的雷珠单抗及其制备方法。本发明专利技术首先提供了一种聚乙二醇定点修饰雷珠单抗，所述的定点修饰的雷珠单抗为单点修饰及两点修饰的PEG

【技术实现步骤摘要】
一种聚乙二醇定点修饰的雷珠单抗及其制备方法


[0001]本专利技术涉及生物医药领域，具体涉及一种聚乙二醇定点修饰的雷珠单抗及其制备方法。

技术介绍

[0002]雷珠单抗(Ranibizumab)是一种重组人源化的IgG1单克隆抗体片段，无Fc区域，分子量为48kDa，在四环素抗性的大肠杆菌中表达。可结合人血管内皮生长因子(VEGF)A的受体结合位点，防止其与血管内皮生长因子受体结合，从而减少血管内皮细胞增殖和降低血管通透性，抑制新生血管生成。Ranibizumab由Genentech(基因泰克)公司研发，商品名为Lucentis(诺适得)，已分别在美国(2006年)、欧洲(2007年)、日本(2009年)、中国(2011年)被批准上市。主要用于湿性年龄相关性黄斑变性、视网膜静脉阻塞引起的黄斑水肿、糖尿病性黄斑水肿、糖尿病性视网膜病变和近视性脉络膜新生血管。
[0003]Ranibizumab给药方式为经玻璃体注射，体内代谢途径有两种，一种途径是直接穿过视网膜到达脉络毛细血管；另一种则是通过前房引流途径。半衰期约为7天。Ranibizumab现已有多种生物类似物，如Byooviz、Ximluci等。这些仿制药的药代动力学数据均与原研产品相近。目前尚无对Ranibizumab进行聚乙二醇修饰的研究。
[0004]聚乙二醇(polyethylene glycol，PEG)是一种pH中性，无毒，水溶性较高的两性聚合物，其重复单元为氧乙烯基，端基为两个羟基，呈线性或支化链状结构。通过将两端的羟基替换为各种活化基团，可制成各种聚乙二醇修饰剂。聚乙二醇修饰剂经化学方法偶联到蛋白上后，可以增加蛋白的体内半衰期并减小蛋白的抗原性，增加蛋白的溶解性和生物利用度并降低蛋白的毒性。聚乙二醇修饰蛋白技术已广泛应用于生物医药领域，被认为是降低蛋白药物的免疫原性，以及改善其药代动力学/药效学性质最有效的方法之一。
[0005]综上，现有的Ranibizumab及类似产品存在体内半衰期较短的问题，且其给药方式具有一定的危险性，因此需要采用适当的技术，延长Ranibizumab在体内的半衰期，减少给药次数，提高患者的依从性并降低其风险。

技术实现思路

[0006]本专利技术的目的是解决现有技术存在的上述技术问题，提供一种聚乙二醇定点修饰的雷珠单抗及其制备方法。
[0007]本专利技术的专利技术人提供了一种新的技术方案，使得该方案相较于现有的雷珠单抗及其类似物，在结合活性相当的情况下，大大延长了动物体内半衰期，解决了现有技术存在的技术问题。
[0008]本专利技术解决技术问题的技术方案如下：
[0009]本专利技术的第一个目的是提供一种聚乙二醇(PEG)定点修饰的雷珠单抗(Ranibizumab)，称为PEG
‑
Rani。所述的定点修饰的雷珠单抗为单点修饰及两点修饰的PEG
‑
Rani混合物，所述的聚乙二醇为直链型或分支型的带有醛基的单烷氧基聚乙二醇，分子量
在4kDa
‑
20kDa之间。
[0010]优选地，雷珠单抗与聚乙二醇连接位点为Ranibizumab轻链或重链的N末端氨基。
[0011]优选地，所述聚乙二醇修饰的雷珠单抗，其结构通式如下：
[0012](RO
‑
(CH2CH2O)
n
‑
(CH2)
p
CO)
m
‑
NH
‑
Ranibizumab light chain
‑
S
‑
S
‑
Ranibizumab heavy chain
‑
NH
‑
(OC(CH2)
p
‑
(CH2CH2O)
n
‑
OR)
q
；
[0013]结构通式中，R为含碳数量不大于4的烷基；m和q均为0或1的整数，但m和q不同时为0；n为80到450的正整数；p为1到3的正整数；Ranibizumab light chain和Ranibizumab heavy chain的氨基酸序列，分别与Drugbank数据库中编号DB01270的雷珠单抗的轻链和重链氨基酸序列一致。
[0014]本专利技术中，所述聚乙二醇修饰剂为带有醛基的单烷氧基聚乙二醇，包括但不限于单烷氧基聚乙二醇丙醛、单烷氧基聚乙二醇丁醛、单烷氧基聚乙二醇乙醛等。优选单甲氧基聚乙二醇丙醛。聚乙二醇修饰剂可以是直链型或分支型，可以是单链、双链或多链。优选直链型单链聚乙二醇修饰剂。
[0015]所述Ranibizumab可以是任何表达系统表达并纯化的，具有和Drugbank上公布的雷珠单抗氨基酸序列(DB01270)一致氨基酸序列的蛋白(https://go.drugbank.com/drugs/DB01270)。当然，也可以包括任何对该序列进行了不影响结构、结合域或修饰位点的修改的产品。
[0016]本专利技术的第二个目的是提供了一种上述的PEG
‑
Rani的制备方法。
[0017]采用1
‑
10mg/ml的雷珠单抗蛋白，加入摩尔数是雷珠单抗蛋白的2
‑
5倍的聚乙二醇修饰剂和摩尔数是蛋白的20
‑
100倍的还原剂，在温度2
‑
8℃下进行修饰反应，反应时间12
‑
48小时，反应结束后分离得到单点修饰及两点修饰的PEG
‑
Rani混合物。
[0018]优选地，所述还原剂为氰基硼氢化钠。Ranibizumab蛋白、PEG与氰基硼氢化钠的摩尔比为1：4：50。所述的分离步骤包括离子交换层析。
[0019]本专利技术的制备方法，具体包括以下步骤：
[0020]1)使用pH 5
‑
6的50mM乙酸
‑
乙酸钠缓冲液配制Ranibizumab溶液，蛋白终浓度为1
‑
10mg/ml；
[0021]2)按一定摩尔比混合Ranibizumab、聚乙二醇修饰剂和还原剂，在温度2
‑
8℃下进行修饰反应，反应时间12
‑
48小时；
[0022]3)反应结束后使用离子交换色谱法进行分离纯化，最终得到单点修饰及两点修饰的PEG
‑
Rani混合物。
[0023]优选地，所述步骤1)中，Ranibizumab蛋白终浓度为5mg/ml。
[0024]优选地，所述步骤2)中，所述聚乙二醇修饰剂平均分子量为4kDa～20kDa，更优选为10kDa。
[0025]优选地，所述步骤2)中，所述反应体系中，聚乙二醇修饰剂的摩尔数是Ranibizumab蛋白的2
‑
5倍，还原剂的摩尔数是Ranibizumab蛋白的20
‑
100倍。优选地，Ranibizumab蛋本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种聚乙二醇定点修饰雷珠单抗，其特征在于，所述的定点修饰的雷珠单抗为单点修饰及两点修饰的PEG
‑
Rani混合物，所述的聚乙二醇为直链型或分支型的带有醛基的单烷氧基聚乙二醇，所述的聚乙二醇的分子量在4kDa
‑
20kDa之间。2.根据权利要求1所述的聚乙二醇定点修饰雷珠单抗，其特征在于，所述的雷珠单抗与聚乙二醇连接位点为Ranibizumab轻链或重链的N末端氨基。3.根据权利要求1所述的聚乙二醇定点修饰雷珠单抗，其特征在于，所述的聚乙二醇修饰的雷珠单抗，其结构通式如下：(RO
‑
(CH2CH2O)
n
‑
(CH2)
p
CO)
m
‑
NH
‑
Ranibizumablightchain
‑
S
‑
S
‑
Ranibizumab heavychain
‑
NH
‑
(OC(CH2)
p
‑
(CH2CH2O)
n
‑
OR)
q
；结构通式中，R为含碳数量不大于4的烷基；m和q均为0或1的整数，但m和q不同时为0；n为80到450的正整数；p为1到3的正整数；Ranibizumab lightchain和R...

【专利技术属性】
技术研发人员：张弨，
申请(专利权)人：修正生物医药杭州研究院有限公司，
类型：发明
国别省市：