一种靶向M2型小胶质细胞的ADSC-Exo及制备方法技术

本发明专利技术涉及ADSC

【技术实现步骤摘要】
一种靶向M2型小胶质细胞的ADSC
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Exo及制备方法


[0001]本专利技术涉及ADSC
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Exo领域，具体涉及一种靶向M2型小胶质细胞的ADSC
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Exo及制备方法。

技术介绍

[0002]ADSC
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Exo是指脂肪间充质干细胞外泌体。外泌体是一种细胞分泌物，可以通过细胞外液体传递信息和分子，对细胞间通讯和调节起到重要作用。脂肪间充质干细胞外泌体是从脂肪干细胞中分离出来的一种外泌体，具有多种生物学功能，如促进细胞增殖、抗炎、抗氧化等。这些功能使得脂肪间充质干细胞外泌体在医学研究和治疗方面具有广泛的应用前景。
[0003]作为中枢神经系统的第一道免疫防线，小胶质细胞在缺血性脑卒中（Ischemic stroke，IS）中扮演着重要角色。脑缺血发生后几分钟，小胶质细胞即活化并释放相应的细胞因子、趋化因子、Ca2+等来调节自身的表型和功能。小胶质细胞通过活化为M1/M2表型来调控炎症反应，维持免疫炎性微环境稳态，抵御缺血、清除凋亡和受损细胞、重塑不适当的神经连接从而帮助神经系统恢复稳态。经典激活的M1型小胶质细胞主要分泌促炎因子，启动炎症反应，引起细胞凋亡及继发损伤。选择性激活的M2型小胶质细胞又分为M2a、M2b、M2c和Mox等多种亚型，可分泌大量神经保护营养因子，在抑制氧化应激、炎症修复、血管生成、髓鞘形成、以及神经元再生方面起重要作用。
[0004]小胶质细胞在卒中后不同阶段呈现不同的功能状态，使其具有神经损伤或神经保护双重作用。促炎型M1小胶质细胞在卒中后短期内持续增加，而抑炎型M2小胶质细胞在卒中后短暂增加，之后迅速下降。因此，通过调控抑炎型M2小胶质细胞数量，抑制免疫炎性微环境，是减少缺血再灌注损伤（Cerebral ischemia
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reperfusion injury，I/R）的关键。已有研究表明，ADSC（脂肪间充质干细胞）能下调脂多糖(LPS)刺激引起的BV2小胶质细胞中炎性细胞因子的分泌，可能是因为ADSC抑制了BV2 M1表型并促进了M2表型极化；也有研究表明，ADSC
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Exo可通过miRNA抑制小胶质细胞M1极化，促进M2表型极化，改善小鼠I/R。目前的研究大多集中在如何抑制促炎型M1小胶质细胞极化或促进抑炎型M2极化。但是，小胶质细胞表型的极化是一个复杂的过程，对极化方向的调控具有一定的挑战。
[0005]外泌体在缺血性脑卒中（Ischemic stroke，IS）治疗中展现了巨大潜力，但在动物实验中已证实其靶向能力是低效的。因此，通过工程技术修饰外泌体以增强其靶向能力变得十分有必要。在脑部疾病的研究中，与静脉注射相比，鼻腔给药可以更有效地将外泌体运输到大脑。但是，经鼻给予ADSC
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Exo也同样会被不同细胞内化，同时研究表明ADSC
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Exo的有效干预剂量在神经元和M2小胶质细胞之间存在差异，M2小胶质细胞对ADSC
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Exo的需求量更大。
[0006]因此，有鉴于此，本专利技术提供一种靶向M2型小胶质细胞的ADSC
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Exo及制备方法。

技术实现思路

[0007]本专利技术的目的在于针对现有技术的不足，提供一种靶向M2型小胶质细胞的ADSC
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Exo及制备方法。
[0008]为了解决上述技术问题，采用如下技术方案：一种靶向M2型小胶质细胞的ADSC
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Exo，将M2pep靶向肽搭载到ADSC
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Exo得到具有靶向M2型小胶质细胞的M2pep
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ADSC
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Exo。
[0009]本专利技术提供另一技术方案一种靶向M2型小胶质细胞的ADSC
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Exo的制备方法，包括以下步骤：首先构建Lamp2b
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M2pep重组质粒，并将重组的所述质粒转染进ADSC中，得M2pep
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ADSC，然后将所述M2pep
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ADSC通过Western blot检测Lamp2b表达，收集所述M2pep
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ADSC分泌的外泌体得到M2pep
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ADSC
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Exo。
[0010]进一步，将原代小胶质细胞诱导成M1型小胶质细胞和M2型小胶质细胞，通过荧光显微镜观察M1型小胶质细胞和M2型小胶质细胞分别对外泌体ADSC
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Exo和M2pep
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ADSC
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Exo的摄取情况。
[0011]进一步，所述M1型小胶质细胞和M2型小胶质细胞分别对外泌体ADSC
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Exo和M2pep
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ADSC
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Exo的摄取过程如下：（1）将BV2细胞以2x104/孔接种于四格板，37℃、5%CO2条件下培养24 h；（2）将不同组别BV2细胞分别诱导成M1型小胶质细胞和M2型小胶质细胞；（3）加入含有PKH
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26标记ADSC
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Exo或M2pep
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ADSC
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Exo的完全培养基，孵育1 h；（4）弃去培养基，PBS缓冲液洗涤细胞2次；（5）4%多聚甲醛室温固定30 min；（6）PBST洗3遍后封片，荧光显微镜观察并记录PKH
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26标记的ADSC
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Exo和M2pep
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ADSC
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Exo被M1型小胶质细胞和M2型小胶质细胞的摄取情况。
[0012]进一步，通过超速离心法收集所述M2pep
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ADSC分泌的外泌体M2pep
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ADSC
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Exo。
[0013]进一步，将所述M2pep
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ADSC
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Exo进行透射电镜检测。
[0014]进一步，将所述M2pep
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ADSC
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Exo进行纳米粒径分析。
[0015]进一步，所述M2pep
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ADSC通过Western blot检测Lamp2b表达的过程如下：（1）组织标本采集：牺牲小鼠后收集模型组梗死侧缺血周边区域皮层脑组织，假手术组收集对应相同位置皮层脑组织；（2）细胞标本采集：将6孔板中的ADSC用PBS洗3次后备用；（3）外泌体标本采集：超速离心法获得ADSC
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Exo；（4）总蛋白提取：含有PMSF和蛋白磷酸酶抑制剂的高强度RIPA裂解液裂解皮层脑组织、ADSC、或ADSC
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Exo，收集样品至离心管，4℃、12000转离心20 min，取上清；（5）样品制备：用BCA蛋白浓度检测试剂盒获得样本蛋白浓度，PBS稀释各组使蛋白浓度一致，4:1比例加入5 x loading buffer,混匀后100℃金属本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种靶向M2型小胶质细胞的ADSC
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Exo，其特征在于：将M2pep靶向肽搭载到ADSC
‑
Exo得到具有靶向M2型小胶质细胞的M2pep
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ADSC
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Exo。2.一种靶向M2型小胶质细胞的ADSC
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Exo的制备方法，其特征在于包括以下步骤：首先构建Lamp2b
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M2pep重组质粒，并将重组的所述质粒转染进ADSC中，得M2pep
‑
ADSC，然后将所述M2pep
‑
ADSC通过Western blot检测Lamp2b表达，收集所述M2pep
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ADSC分泌的外泌体得到M2pep
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ADSC
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Exo。3.根据权利要求2所述的一种靶向M2型小胶质细胞的ADSC
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Exo的制备方法，其特征在于：将原代小胶质细胞诱导成M1型小胶质细胞和M2型小胶质细胞，通过荧光显微镜观察M1型小胶质细胞和M2型小胶质细胞分别对外泌体ADSC
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Exo和M2pep
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ADSC
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Exo的摄取情况。4.根据权利要求3所述的一种靶向M2型小胶质细胞的ADSC
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Exo的制备方法，其特征在于：所述M1型小胶质细胞和M2型小胶质细胞分别对外泌体ADSC
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Exo和M2pep
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ADSC
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Exo的摄取过程如下：（1）将BV2细胞以2x104/孔接种于四格板，37℃、5%CO2条件下培养24 h；（2）将不同组别BV2细胞分别诱导成M1型小胶质细胞和M2型小胶质细胞；（3）加入含有PKH
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26标记ADSC
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Exo或M2pep
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ADSC
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Exo的完全培养基，孵育1h；（4）弃去培养基，PBS缓冲液洗涤细胞2次；（5）4%多聚甲醛室温固定30 min；（6）PBST洗3遍后封片，荧光显微镜观察并记录PKH
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26标记的ADSC
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Exo和M2pep
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ADSC
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Exo被M1型小胶质细胞和M2型小胶质细胞的摄取情况。5.根据权利要求2所述的一种靶向M2型小胶质细胞的ADSC
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Exo的制备方法，其特征在于：通过超速离心法收集所述M2pep
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ADSC分泌的外泌体M2pep
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ADSC
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Exo。6.根据权利要求2所述的一种靶向M2型小胶质细胞的ADSC
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Exo的制备方法，其特征在于：将所述M2pep
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ADSC
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Exo进行透射电镜检测。7.根据权利要求2所述的一种靶向M2型小胶质细胞的ADSC
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Exo的制备方法，其特征在于：将所述M2pep
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ADSC
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Exo进行纳米粒径分析。8.根据权利要求2所述的一种靶向M2型小胶质细胞的ADSC

【专利技术属性】
技术研发人员：赵静，汪勇，刘卓航，张增雨，初敏，
申请(专利权)人：上海市闵行区中心医院，
类型：发明
国别省市：